帕金森氏病 (PD) 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其隱含特征是黑質(zhì)致密部 (SNpc) 中多巴胺能 (DA) 神經(jīng)元逐步喪失，并明確表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、強(qiáng)直、靜止性震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)。

目前，可用的治療方法主要是姑息策略，包括 L-3,4-二羥基苯丙氨酸 (L-DOPA) 替代療法、DA 受體激動(dòng)劑和深部腦刺激 (DBS) 程序。然而，隨著疾病的進(jìn)展，藥物治療效果不可避免地會(huì)消失，更糟糕的是，運(yùn)動(dòng)反應(yīng)振蕩的副作用以及 L-DOPA 誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙 (LID)。因此，上述令人沮喪的狀況推動(dòng)了向細(xì)胞替代療法 (CRT) 的轉(zhuǎn)變，一種有前途的恢復(fù)療法，旨在確?；颊甙Y狀的持久緩解。

目前，研究最多的用于DA神經(jīng)元衍生的干細(xì)胞來(lái)源是人胎兒腹側(cè)中腦（hfVM）細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞（hESCs）、人神經(jīng)干/前體/祖細(xì)胞（hNSCs/hNPCs）、人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)、人誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞 (hiNSCs) 和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSCs），它們有望成為恢復(fù)性治療方案（見(jiàn)圖1)。關(guān)于PD，估計(jì)SN中 30%的DA細(xì)胞損失以及紋狀體DA神經(jīng)元神經(jīng)支配減少60%以上可導(dǎo)致臨床特征的出現(xiàn)。

因此，任何類型的CRT方案都需要將黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)至少恢復(fù)到正常水平的30%才能有效。為了保證未來(lái)基于干細(xì)胞的CRT的標(biāo)準(zhǔn)化和均質(zhì)化，理想的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合以下協(xié)議：

1. 產(chǎn)生足夠的可用于移植的神經(jīng)譜系特異性細(xì)胞系；

2. 植入后細(xì)胞的持續(xù)存活（即數(shù)年）；

3. 分化成足夠數(shù)量（大約 100,000 個(gè)）的黑質(zhì) DA 神經(jīng)元，并有證據(jù)表明移植細(xì)胞釋放多巴胺；

4. 這些細(xì)胞移植后的行為恢復(fù)；

5. 沒(méi)有證據(jù)表明腫瘤形成或分化為進(jìn)一步破壞黑質(zhì)紋狀體回路的神經(jīng)元/細(xì)胞；

6、符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）標(biāo)準(zhǔn)；

在這篇綜述中，我們建議詳細(xì)介紹干細(xì)胞系的制備和應(yīng)用，尤其是用于PD研究和治療的ESC、NSC/NPC、iNSC、MSC和iPSC（見(jiàn)圖1）。由于更優(yōu)越的多能性、更獨(dú)特的分化特征和更多認(rèn)可的來(lái)源，iPSC似乎是更優(yōu)先的CRT候選者。此外，還將闡述PD患者實(shí)用干細(xì)胞治療的現(xiàn)狀、未來(lái)前景和CRT相關(guān)炎癥問(wèn)題。

胚胎干細(xì)胞 (ESC)

ESCs來(lái)源于發(fā)育中囊胚的內(nèi)部團(tuán)塊，在某些正常情況下具有自我更新和產(chǎn)生所有三個(gè)主要胚層——外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞的潛力（見(jiàn)圖1）。

在體外誘導(dǎo)ESC進(jìn)一步分化的嘗試涉及幾種不同的方法（參見(jiàn)圖2）。

整個(gè)過(guò)程分為以下三個(gè)步驟： (1) 從胚泡內(nèi)塊分離胚胎干細(xì)胞；(2) 通過(guò) (i) 應(yīng)用形態(tài)發(fā)生素或可溶性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ESC分化為DA神經(jīng)元；(ii) 飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)；(iii) 遺傳操作；(iv) 底板譜系誘導(dǎo)策略；(3) 通過(guò)功能整合和內(nèi)源性NPCs動(dòng)機(jī)在PD治療中移植誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元。

例如，通過(guò)應(yīng)用多種形態(tài)發(fā)生素如全反式維甲酸 (RA)、聲波刺猬 (SHH)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白，顯著改善了神經(jīng)譜系誘導(dǎo)(BMPs) 和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）所有這些都用作神經(jīng)源性刺激物，這對(duì)于正常的胚胎發(fā)育和分化也是必不可少的（見(jiàn)表1）。

到目前為止，已有多項(xiàng)證據(jù)表明，源自ESC的富含DA的移植物在移植到PD動(dòng)物模型后通常保持其DA誘導(dǎo)的表型、延長(zhǎng)的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)、表達(dá)突觸標(biāo)記并產(chǎn)生相當(dāng)大的行為恢復(fù)（見(jiàn)表1)。與PD動(dòng)物模型的結(jié)果類似，接受人類胎兒組織移植的患者表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)缺陷顯著減少，移植物存活率、多巴胺釋放和DA神經(jīng)元的突觸整合。

主要問(wèn)題

然而，與所有多能干細(xì)胞的情況一樣，hESC 可能會(huì)在預(yù)期的移植區(qū)域產(chǎn)生畸胎瘤。此外，移植的胚胎干細(xì)胞可能會(huì)穿過(guò)血腦屏障，在功能上整合到異位腦區(qū)并分泌活性因子，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）產(chǎn)生不良影響。此外，同種異體 hES 細(xì)胞及其衍生物在移植到受體大腦中時(shí)可能會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。除此之外，移植物引起的肌張力障礙和運(yùn)動(dòng)障礙是另一個(gè)棘手的問(wèn)題。針對(duì)以上擔(dān)憂，未來(lái)的干細(xì)胞研究可以做些什么呢？

總的來(lái)說(shuō)，必須通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選 (FACS)、磁激活細(xì)胞分選 (MACS)、有絲分裂阻滯和/或定向分化等方法，從最終移植產(chǎn)品中去除或減少殘余ESC至安全水平，以便減少致瘤危害。此外，對(duì)移植細(xì)胞生物分布、潛在異位毒性的評(píng)估以及對(duì)ESC衍生細(xì)胞的免疫狀態(tài)和經(jīng)歷神經(jīng)退行性損傷的CNS的了解將更好地保證基于 ESC 的 CRT 在PD中的成功。遺憾的是，由于上述潛在問(wèn)題，到目前為止，還沒(méi)有美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA) 批準(zhǔn)使用 hESC 衍生細(xì)胞在 PD 患者中進(jìn)行移植的正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。然而，鑒于迷人的內(nèi)在分化能力和全球研究人員的共同努力，hESCs 衍生的 DA 神經(jīng)元必將達(dá)到臨床階段并轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC)

1990年代早期在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞和祖細(xì)胞，挑戰(zhàn)了著名科學(xué)家 Ramony等人長(zhǎng)期存在的“無(wú)新神經(jīng)元”學(xué)說(shuō)。打開(kāi)神經(jīng)干細(xì)胞用于PDCRT的潛力的窗口。NSCs是干細(xì)胞的一種亞型，能夠在胚胎和成人中自我更新并產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的主要表型，致力于神經(jīng)譜系分化，并可能在體內(nèi)形成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。

神經(jīng)干細(xì)胞移植在帕金森病治療中的制備（直接分離或誘導(dǎo)分化）和各自應(yīng)用的流程圖

NSCs可分為三類：（1）內(nèi)源性NSCs，直接從成人CNS組織中分離（A）；

(2) 干細(xì)胞衍生的NSCs，通過(guò)不同的分化方案從各種干細(xì)胞誘導(dǎo)(A)；

(3) iNSC，由Sox2從小鼠或人成纖維細(xì)胞重新編程，有或沒(méi)有其他轉(zhuǎn)錄因子(B);?所有這些都可以進(jìn)一步分選和純化以獲得可行的NSCs。

其中，干細(xì)胞衍生的神經(jīng)干細(xì)胞可以通過(guò)以下兩種方案進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為多巴胺神經(jīng)元：（i）添加生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子等。培養(yǎng)基誘導(dǎo)神經(jīng)球形成；(ii) 與永生化 NSC 系共培養(yǎng)以引入基因修飾因子。當(dāng)將上述可行的NSCs和感受態(tài)DA神經(jīng)元應(yīng)用于PD的CRT治療時(shí)，可以觀察到改善的神經(jīng)元存活狀態(tài)和恢復(fù)性功能缺陷。

PD是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，被認(rèn)為是受影響大腦區(qū)域NSCs池缺乏的結(jié)果，是CRT的合適候選者。因此，高度期待將NSCs（內(nèi)源性NSCs、iNSCs或干細(xì)胞衍生的神經(jīng)干細(xì)胞）替換到受損大腦中作為PD的可能治療手段（見(jiàn)圖1）。在成功建立多種來(lái)源的神經(jīng)干/前體/祖細(xì)胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和長(zhǎng)期生產(chǎn)人類NPC對(duì)神經(jīng)科學(xué)家和臨床神經(jīng)移植試驗(yàn)都具有巨大的實(shí)用價(jià)值。

PD是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，被認(rèn)為是受影響大腦區(qū)域NSCs池缺乏的結(jié)果，是CRT的合適候選者。因此，高度期待將NSCs（內(nèi)源性 NSCs、iNSCs或干細(xì)胞衍生的神經(jīng)干細(xì)胞）替換到受損大腦中作為PD的可能治療手段（見(jiàn)圖1）。在成功建立多種來(lái)源的神經(jīng)干/前體/祖細(xì)胞 (NPC/NSC) 后，快速、可靠和長(zhǎng)期生產(chǎn)人類 NPC 對(duì)神經(jīng)科學(xué)家和臨床神經(jīng)移植試驗(yàn)都具有巨大的實(shí)用價(jià)值。

間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)

MSCs是一種非造血多能亞型細(xì)胞系，主要來(lái)源于骨髓的基質(zhì)結(jié)構(gòu) ，而不是脂肪組織、臍帶、真皮和外周血，在體內(nèi)一般分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。

一般而言，有兩類MSC：天然MSC（直接從間充質(zhì)組織分離）和神經(jīng)誘導(dǎo)的MSC，它們都對(duì)PD治療具有巨大前景（見(jiàn)圖4）。其中，天然骨間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和神經(jīng)誘導(dǎo)骨間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）均已通過(guò)多組PD模型的治療效果測(cè)試，均顯示移植細(xì)胞存活、TH表達(dá)和明顯的行為恢復(fù)，但神經(jīng)誘導(dǎo)的 BMSCs 的修復(fù)效果似乎更明顯。此外，從脂肪組織和臍帶中分離出的MSCs在PD模型中同樣顯示出有益效果。此外，基因工程MSCs也被證明在PD治療中表現(xiàn)出治療潛力。大量研究表明，生長(zhǎng)因子（特別是 GDNF、VEGF 和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）的蛋白質(zhì)或基因遞送在一系列嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類PD模型中有效保護(hù)多巴胺神經(jīng)元（見(jiàn)表1）。

MSCs可分為三種類型：na?veMSCs、神經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs和基因工程的MSCs，它們都可以在移植后直接發(fā)揮內(nèi)在治療作用，例如（i）分泌中性粒細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等；(ii) 內(nèi)源性 MSCs 動(dòng)機(jī)、神經(jīng)發(fā)生和血管生成；(iii) 免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。

此外，MSCs可以通過(guò)（i）化學(xué)刺激誘導(dǎo)分化為多巴胺神經(jīng)元；(ii) 基因轉(zhuǎn)染；(iii) 飼料細(xì)胞共培養(yǎng)；(iv) 使用條件培養(yǎng)基。移植后，MSCs 和分化的 DA 神經(jīng)元表現(xiàn)出 (a) 在毒素?fù)p傷后持續(xù)的神經(jīng)元存活；(b) 增強(qiáng)多巴胺神經(jīng)元再生和修復(fù)；(c) 功能缺陷恢復(fù)。

迄今為止，有以下幾種可能的潛在機(jī)制解釋了MSC 對(duì)PD的治療效果（見(jiàn)圖6）。

1. 分泌各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 蛋白和有效的神經(jīng)調(diào)節(jié)分子，為神經(jīng)再生創(chuàng)造有利環(huán)境。

2. 激活內(nèi)源性恢復(fù)機(jī)制以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生并減少 DA 神經(jīng)元的損失（抗細(xì)胞凋亡）。

3.免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。

現(xiàn)狀與未來(lái)展望

作為一種有前途的恢復(fù)性治療替代方案，干細(xì)胞療法作為一種有前途的再生療法已成為PD研究領(lǐng)域的前沿，尤其是與MSC相關(guān)的療法。一方面，MSC可以很容易地獲得和擴(kuò)展，而無(wú)需使用其他支持性細(xì)胞。另一方面，MSC不受與ESC相關(guān)的倫理和免疫排斥問(wèn)題的影響。

遺憾的是，觀察到的MSCs衍生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)少，無(wú)法恢復(fù)正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，盡管一些體內(nèi)研究表明MSCs能夠在移植后分化為神經(jīng)元細(xì)胞。因此，如何在未來(lái)的研究中產(chǎn)生足夠多且特異的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞亞型以適應(yīng)細(xì)胞移植是一個(gè)需要理順的首要問(wèn)題。與ESC和NSC的情況一樣，應(yīng)解決與腫瘤形成、免疫排斥和生物分布相關(guān)毒性相關(guān)的安全問(wèn)題，以便最終將MSC轉(zhuǎn)化為PD治療選擇。我們相信，盡管MSC研究仍處于臨床管道的啟動(dòng)階段，但 MSC 很有希望成為可用于PDCRT的干細(xì)胞庫(kù)的成員。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)

2006年Yamanaka 等人已經(jīng)表明，ESC樣細(xì)胞可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒引入OSKM基因轉(zhuǎn)錄因子從胚胎和成年小鼠成纖維細(xì)胞中衍生出來(lái)，后來(lái)獲得諾貝爾獎(jiǎng)獎(jiǎng)勵(lì)“發(fā)現(xiàn)成熟的體細(xì)胞可以重新編程以重新進(jìn)入多能性”。從重編程過(guò)程中獲得的類ESC多能細(xì)胞被稱為iPSC（見(jiàn)圖1）。

與其他類型的干細(xì)胞相比，iPSCs憑借更優(yōu)越的多能性、更獨(dú)特的分化特征和更容易獲得的來(lái)源，似乎是更優(yōu)先的CRT候選者。下文將進(jìn)一步闡述多種多樣的iPSCs的制備、應(yīng)用、現(xiàn)狀、潛在挑戰(zhàn)和未來(lái)前景。

iPSCs在帕金森病中的應(yīng)用

研究表明，基于蛋白質(zhì)的人類iPSC很有希望成為臨床轉(zhuǎn)化的有前途的細(xì)胞來(lái)源，這些hiPSC的行為與hESC相似，沒(méi)有異常衰老/細(xì)胞凋亡，沒(méi)有顯示任何外源性重編程基因表達(dá)，并且DA神經(jīng)元來(lái)自人類piPSC顯著改善PD嚙齒動(dòng)物模型中的行為缺陷（參見(jiàn)表3)?？傊瑢?duì)于與PD相關(guān)的干細(xì)胞研究和治療領(lǐng)域，除了現(xiàn)有的基于病毒和蛋白質(zhì)的iPSCs外，還應(yīng)將更多的精力和注意力投入到多元化建立的iPSCs上，這將極大地促進(jìn)CRT的進(jìn)一步發(fā)展如果實(shí)施，用于PD治療。

現(xiàn)狀與未來(lái)展望

一般來(lái)說(shuō)，理想的iPSCs的建立集中在適用的體細(xì)胞來(lái)源、重編程因子的適當(dāng)組合、有效的遞送方法和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。根據(jù)iPSC的目的和應(yīng)用，有關(guān)體細(xì)胞類型、重編程因子、遞送方法和培養(yǎng)條件的選擇在很大程度上有所不同，其中詳細(xì)闡述了重編程因子和遞送載體。在上述協(xié)議的基礎(chǔ)上，已經(jīng)成功地建立了從各種體細(xì)胞到iPSC的轉(zhuǎn)分化，并且iPSC衍生的DA神經(jīng)元也被證明可以挽救PD動(dòng)物模型中的運(yùn)動(dòng)缺陷。盡管取得了上述成就，但臨床上可行的iPSC的生成仍然存在局限性。

用于帕金森病治療的干細(xì)胞亞型的優(yōu)缺點(diǎn)

胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和iPSC等多種類型的干細(xì)胞已應(yīng)用于PD相關(guān)的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)研究，其中許多已轉(zhuǎn)化為PD模型移植，結(jié)果參差不齊。分別闡述了上述干細(xì)胞的制備、誘導(dǎo)分化、初步應(yīng)用、當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來(lái)前景。然后比較干細(xì)胞亞型在PD治療中的優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表4）。

ESCs來(lái)源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，可以全能分化為三個(gè)胚層，包括黑質(zhì)DA神經(jīng)。此外，ESCs衍生的DA神經(jīng)元在移植到PD動(dòng)物模型后已證明，神經(jīng)突長(zhǎng)出延長(zhǎng)，特定突觸標(biāo)記物的表達(dá)和功能缺陷的緩解。然而，將這些細(xì)胞用于PD治療仍然存在一些嚴(yán)重的問(wèn)題，例如腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)、倫理問(wèn)題和免疫排斥，因此需要更多的研究以保證在PD治療中的進(jìn)一步應(yīng)用。

至于NSC，與ESC相比的一個(gè)潛在優(yōu)勢(shì)是，除了神經(jīng)譜系分化受限外，它們?cè)谝浦埠蟛灰仔纬赡[瘤和引起免疫排斥反應(yīng)。然而，神經(jīng)干細(xì)胞顯示出一些缺點(diǎn)，如有限的分化能力和來(lái)源、揮之不去的倫理問(wèn)題、帕金森癥狀的部分緩解。

相比之下，一些研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有上述缺點(diǎn)，可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有更大的治療潛力。

結(jié)論

盡管細(xì)胞替代療法是治療帕金森和其他神經(jīng)退行性疾病的有前途的途徑，但仍然存在許多障礙，如腫瘤發(fā)生、免疫反應(yīng)、低干細(xì)胞產(chǎn)量和生物分布相關(guān)的毒性，有待解決，以便能夠開(kāi)發(fā)出可以轉(zhuǎn)化為有效且普遍接受的臨床應(yīng)用的新方法。除此之外，疾病階段和嚴(yán)重程度也可能對(duì)細(xì)胞替代療法的效果產(chǎn)生影響?？傊?，細(xì)胞替代療法實(shí)踐仍處于起步階段，因此我們必須在未來(lái)的研究中建立更多的干細(xì)胞系，以推動(dòng)與帕金森病相關(guān)的干細(xì)胞研究和治療從實(shí)驗(yàn)室到臨床。