腎臟疾病是世界范圍內(nèi)的主要健康問題。盡管藥物治療取得了進(jìn)展，但它們只能減緩腎臟疾病的進(jìn)展。因此，人們開始探索利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的潛在策略。再生策略有兩個不同的方向，利用干細(xì)胞進(jìn)行全腎重新制造和干細(xì)胞治療。全腎重新制造策略包括：

• 1）脫細(xì)胞支架技術(shù)，
• 2）基于工程技術(shù)的3D生物打印，
• 3）腎臟類器官制造，
• 4）囊胚嵌合技術(shù)，
• 5）器官發(fā)生微環(huán)境方法。

同時，干細(xì)胞治療策略包括

• 1）注射干細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、腎元祖細(xì)胞、成體腎干細(xì)胞和多譜系分化應(yīng)激細(xì)胞，
• 2）注射這些干細(xì)胞分泌的保護(hù)因子，包括生長因子、趨化因子和含有microRNA、mRNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡。

利用干細(xì)胞療法進(jìn)行腎臟再生的潛在策略：概述

在過去的幾十年里，這些策略取得了顯著的進(jìn)步。

本文，我們回顧了利用干細(xì)胞治療腎病進(jìn)行腎臟再生的潛在策略的最新進(jìn)展，以及未來可能在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。

介紹

全球范圍內(nèi)慢性腎臟病 (CKD) 患者的發(fā)病率持續(xù)上升，CKD已成為日益嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)。終末期腎臟病 (ESKD) 需要腎臟替代治療，包括血液透析、腹膜透析和腎移植。2010年，有261萬人接受了透析或腎移植，預(yù)計到2030年這一數(shù)字將翻一番。由于供體數(shù)量少且移植后需服用免疫抑制藥物，只有少數(shù)人能夠接受腎移植。

同時，透析治療并不能完全取代腎臟的作用，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，并因心血管疾病等并發(fā)癥導(dǎo)致預(yù)后不良。盡管近年來技術(shù)取得了進(jìn)展，包括可穿戴人工腎臟和生物人工腎小管輔助裝置 (RAD)，但仍然難以補(bǔ)償整個腎臟功能。因此，建立腎臟再生療法非常重要，而使用干細(xì)胞的策略可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的潛在選擇之一。

利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的策略有兩個方向：“重建”和“修復(fù)”。其中“重建”策略包括利用干細(xì)胞從頭制造腎臟并通過移植進(jìn)行替換，“修復(fù)”策略包括誘導(dǎo)原生腎臟修復(fù)系統(tǒng)（圖1）。

從頭腎臟制造的策略有幾種，包括

• 1）脫細(xì)胞支架技術(shù)，
• 2）基于工程技術(shù)的3D生物打印，
• 3）腎臟類器官制造，
• 4）囊胚互補(bǔ)技術(shù)，
• 5）器官發(fā)生生態(tài)位法。

誘導(dǎo)原生腎臟修復(fù)系統(tǒng)包括

• 1）注射干細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、腎元祖細(xì)胞（NPCs）、成體腎干細(xì)胞和多譜系分化應(yīng)激（Muse）細(xì)胞，
• 2）注射干細(xì)胞分泌的保護(hù)因子。在過去的幾十年里，兩個方向都取得了顯著的循序漸進(jìn)的發(fā)展。

在這里，我們總結(jié)了目前利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的潛在策略，以及它們在腎臟疾病患者臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。

新腎制造的方法有哪些？

脫細(xì)胞腎臟

脫細(xì)胞策略是從頭制造腎臟的選項(xiàng)之一。該方法使用洗滌劑，例如十二烷基硫酸鈉 (SDS) 和 Triton X-100，去除整個器官中的細(xì)胞，然后注入特定細(xì)胞（例如干細(xì)胞），使其分化為成熟細(xì)胞并與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 一起植入脫細(xì)胞支架中。這一概念首先應(yīng)用于心臟，然后應(yīng)用于肺、肝臟和腎臟。

對于腎臟，將小鼠胚胎干細(xì)胞 (ES) 注射到大鼠脫細(xì)胞腎臟中，在那里觀察到分化為ES細(xì)胞衍生的血管、腎小球和腎小管。另一個研究小組也應(yīng)用了這一概念，將小鼠ES細(xì)胞接種到來自腎動脈的去細(xì)胞大鼠腎臟上，結(jié)果顯示接種細(xì)胞在血管系統(tǒng)和腎小球毛細(xì)血管中分布均勻，沒有凋亡跡象。還通過將來自腎動脈的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 注射到去細(xì)胞大鼠腎臟和來自輸尿管的大鼠新生腎細(xì)胞中，研究了再細(xì)胞化腎臟的尿液產(chǎn)生情況。

3D生物打印

3D生物打印的應(yīng)用是從頭制造腎臟的另一種方法。生物打印是一種技術(shù)，涉及逐層精確沉積生物墨水（通常是含有細(xì)胞的水凝膠）或生物材料墨水（不含細(xì)胞），以構(gòu)建復(fù)雜的組織或器官。有幾篇關(guān)于耳朵等組織構(gòu)建的報道，但尚未報道從頭制造整個腎臟。整個腎臟的構(gòu)建面臨多項(xiàng)挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞類型和生物材料的選擇，以及腎臟結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其細(xì)胞類型的多樣性。盡管如此，據(jù)報道取得了重要的一步，即利用 3D 生物打印技術(shù)生成了血管化結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)以及近端上皮細(xì)胞。

同一研究小組進(jìn)一步開發(fā)了一種具有內(nèi)皮和上皮通道的雙通道腎臟模型。他們使用明膠和纖維蛋白的混合物作為ECM材料，并在生物打印后對細(xì)胞進(jìn)行后接種。

此外，該產(chǎn)品可能對體外藥物腎毒性測試和疾病建模有用。3D生物打印技術(shù)還用于腎臟類器官模型，以進(jìn)行高通量藥物腎毒性分析，其中iPS細(xì)胞衍生的類器官是通過3D生物打印方法生產(chǎn)的，具有更高的可重復(fù)性和更短的時間范圍。

類器官

利用自組織技術(shù)從多能干細(xì)胞 (PSC) 構(gòu)建腎臟器官是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。一般而言，從PSC進(jìn)行自組織誘導(dǎo)應(yīng)基于對腎臟發(fā)育的了解。

腎單位由三種類型的祖細(xì)胞組成：NPC、輸尿管芽 (UB) 和基質(zhì)祖細(xì)胞。NPC通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化形成管狀上皮細(xì)胞和腎小球。UB通過多個分支分化為集合管。基質(zhì)祖細(xì)胞分化為間質(zhì)細(xì)胞。多個研究小組已報道通過從PSC分化誘導(dǎo)NPC。Taguchi等人通過多個步驟結(jié)合多種生長因子從iPS細(xì)胞中建立了NPC。此外，通過將NPC與小鼠胚胎的脊髓一起培養(yǎng)，他們成功創(chuàng)建了包含3D腎小球和腎小管的腎臟結(jié)構(gòu)。其他研究小組也建立了使用PSC衍生的NPC構(gòu)建3D腎元（包括腎小球和腎小管）的方案。

然而，通過將類器官移植到小鼠體內(nèi)，構(gòu)建的類器官連接了宿主的血管網(wǎng)絡(luò)。盡管取得了這些逐步的發(fā)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。

• 首先，目前報道的類器官尺寸太小，無法產(chǎn)生足夠的尿液來維持體內(nèi)平衡。
• 其次，需要與大血管進(jìn)行運(yùn)輸。有幾個研究小組報道了通過將腎類器官移植到腎包膜下來構(gòu)建血管系統(tǒng)，但這些方法都相當(dāng)簡單。盡管如此，最近一項(xiàng)利用微流控芯片上的流動創(chuàng)建腎類器官的研究顯示，血管網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)張，足細(xì)胞和腎小管區(qū)室成熟，細(xì)胞極性和成體基因表達(dá)水平更高，表明腎類器官中血管系統(tǒng)的進(jìn)展。
• 第三，仍然需要從 PSC 建立基質(zhì)祖細(xì)胞。
• 第四，類器官的成熟仍然是一個重要問題。Taguchi等人。報道稱，所制備的腎類器官在7天培養(yǎng)中與E15.5腎臟相當(dāng)。除了通過PSC制造外，另有報道稱可從成體腎干細(xì)胞產(chǎn)生腎類器官。

通過在Matrigel中培養(yǎng)具有多種生長因子的成體腎干細(xì)胞簇，細(xì)胞簇分化為腎小球、小管上皮細(xì)胞和集合管，表明存在具有分化為NPC和UB譜系能力的成體腎干細(xì)胞。

總之，類器官技術(shù)可能有助于探索特定疾病和/或治療機(jī)制，以及治療藥物篩選。

囊胚互補(bǔ)

囊胚補(bǔ)充法是將PSC植入部分組織/器官缺陷的動物未分化生殖細(xì)胞中，并從植入的PSC中衍生出缺陷部分的方法。通過將此策略應(yīng)用于Pdx1缺陷的胰腺生成障礙嚙齒動物模型，創(chuàng)建了PSC衍生的胰腺。建立的胰腺主要來自植入的PSC。此策略也應(yīng)用于腎臟。通過將ES細(xì)胞注射到缺乏Sall1基因（該基因?qū)τ诤竽I間充質(zhì)發(fā)育至關(guān)重要）的小鼠囊胚中，Usui等人成功實(shí)現(xiàn)了PSC衍生的腎臟的生產(chǎn)；腎小球和腎小管細(xì)胞來自 ES 細(xì)胞，而其他集合管和血管細(xì)胞則來自宿主。

此外，還報道了跨物種產(chǎn)生。Goto等人在跨物種實(shí)驗(yàn)中將小鼠來源的ES細(xì)胞移植到Sall1缺陷大鼠體內(nèi)，成功制備了小鼠PSC來源的腎臟，其中腎小球和腎小管上皮完全由小鼠PSC來源的細(xì)胞組成，輸尿管-膀胱連接處形成正常，這表明可以在異種宿主中使用該策略，例如使用人PSC。

器官生態(tài)位方法

器官微環(huán)境法利用后期胚胎腎臟的器官微環(huán)境，應(yīng)用囊胚補(bǔ)充的概念，將器官祖細(xì)胞植入器官發(fā)育的部位和時間，并在生長中的胎兒系統(tǒng)中進(jìn)行離體培養(yǎng)以分化為器官。

干細(xì)胞治療

干細(xì)胞給藥

干細(xì)胞注射是誘導(dǎo)再生機(jī)制的一種選擇。植入干細(xì)胞有兩種機(jī)制：通過遷移、分化和植入到受損部位替換受損組織，以及植入干細(xì)胞的旁分泌作用。

干細(xì)胞注射的優(yōu)勢在于其歸巢效應(yīng)；植入的干細(xì)胞遷移到受損組織并可能有助于局部旁分泌作用。

有大量已發(fā)表的報告表明MSC靜脈注射對嚙齒動物急性腎損傷 (AKI) 模型（由藥物或缺血/再灌注 (I/R) 損傷引起）和CKD模型（例如5/6腎切除術(shù)、糖尿病腎病和單側(cè)輸尿管梗阻）的再生作用。雖然據(jù)報道MSC衍生細(xì)胞植入是一種直接替代機(jī)制，但證據(jù)表明，主要的營養(yǎng)作用可歸因于旁分泌作用。MSC可從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織和臍帶。盡管MSC來源可能存在異質(zhì)性，但據(jù)報道，每種MSC都具有腎保護(hù)作用。

關(guān)于腎臟特異性干細(xì)胞，Kitamura等人建立了成體腎臟干細(xì)胞，通過替換受損組織，施用這些細(xì)胞可改善 I/R誘發(fā)的AKI模型中的腎功能。此外，有幾份報告證明，在藥物或I/R誘發(fā)的急性腎損傷和5/6腎切除術(shù)誘發(fā)的慢性腎病中，PSC衍生的NPC治療可以保留腎功能。

此外，據(jù)報道，Muse細(xì)胞（可從各種器官收集的非致瘤性內(nèi)源性多能樣干細(xì)胞）的治療可通過歸巢到受損腎小球并分化為腎小球細(xì)胞來改善阿霉素誘導(dǎo)的局灶節(jié)段性腎小球硬化模型。

總之，干細(xì)胞治療腎病可能通過直接和間接機(jī)制對急性腎損傷和慢性腎病均具有治療潛力。

干細(xì)胞分泌組的管理

由于干細(xì)胞治療的旁分泌作用可能在干細(xì)胞治療中發(fā)揮主要作用，因此干細(xì)胞的分泌組和再生機(jī)制備受關(guān)注。MSCs的分泌組以及再生機(jī)制已得到很好的總結(jié)。先前的報告顯示，旁分泌機(jī)制包括細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥、血管生成和腎小管細(xì)胞去分化。人們認(rèn)為，各種因素協(xié)同作用來介導(dǎo)這些機(jī)制。

MSCs可能分泌生長因子、趨化因子和含有微小RNA (miRNA)、mRNA 和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡 (EVs) 。作為生長因子，MSC分泌肝細(xì)胞生長因子 (HGF)、表皮生長因子樣生長因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF) 和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)，據(jù)報道，這些因子均具有腎臟保護(hù)作用。

此外，越來越多的證據(jù)表明，來自MSC的含有EV的miRNA是干細(xì)胞治療中的重要貢獻(xiàn)者。來自MSC的營養(yǎng)性miRNA包括miR-21、miR-199、Let-7家族和miR-30，它們可能通過與3′-UTR結(jié)合而沉默其靶基因。還有報道稱，這些分泌蛋白組可能受到多種刺激的修飾，包括缺氧、炎癥刺激和改變的培養(yǎng)條件。由于EVs可以作為一種天然的藥物輸送系統(tǒng)，將多種因子高穩(wěn)定性地運(yùn)送到遠(yuǎn)處的器官，因此利用特定的miRNAs來治療來自干細(xì)胞的EVs可能是另一個有前途的選擇。

結(jié)論

這里，我們總結(jié)了干細(xì)胞應(yīng)用的兩個方向“重建”和“修復(fù)”。對于這兩種方法，臨床應(yīng)用仍存在一些挑戰(zhàn)。關(guān)于“重建”方法，需要血管侵入腎臟、腎臟大小足以產(chǎn)生尿液、誘導(dǎo)不顯示尿蛋白的足細(xì)胞以及通過尿液流入腎小管并重新吸收重要物質(zhì)的詳細(xì)機(jī)制產(chǎn)生腎臟。

由于結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，腎臟的重建與其他器官相比很困難。然而，考慮到過去幾十年的快速發(fā)展，“重建”技術(shù)在未來可能是可能的。

關(guān)于“修復(fù)”，我們?nèi)匀恍枰U明腎臟的再生機(jī)制，以便我們可以使用干細(xì)胞或干細(xì)胞介導(dǎo)的分泌體激活這些機(jī)制。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但使用干細(xì)胞進(jìn)行再生治療是一種有前途的腎保護(hù)策略。

參考資料：Tsuji K, Kitamura S and Wada J (2022) Potential Strategies for Kidney Regeneration With Stem Cells: An Overview. Front. Cell Dev. Biol. 10:892356. doi: 10.3389/fcell.2022.892356

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