關(guān)節(jié)軟骨是人體眾多關(guān)節(jié)中常見的軟骨類型。然而，軟骨的再生能力有限。人們已經(jīng)采用了一系列方法來幫助45歲以下患有軟骨缺陷的成年人，但骨關(guān)節(jié)炎等其他軟骨病理僅限于非甾體抗炎藥和全關(guān)節(jié)置換術(shù)。

細(xì)胞療法和合成生物學(xué)不僅可用于治療軟骨缺陷，而且有潛力成為一種治療方法促進(jìn)軟骨再生并可能逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎。細(xì)胞修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨的潛力，以及利用合成生物學(xué)進(jìn)行基因工程細(xì)胞干細(xì)胞方法，重點(diǎn)是自體軟骨細(xì)胞植入和基質(zhì)自體軟骨細(xì)胞植入。然后，我們將討論細(xì)胞療法。在這篇綜述中，我們將介紹當(dāng)前細(xì)胞療法治療軟骨缺損再生的方法。

軟骨再生細(xì)胞療法

微骨折和嫁接：當(dāng)前的黃金標(biāo)準(zhǔn)

微骨折 (MF) 也稱為骨髓刺激，用于小于2cm的軟骨缺損。在此過程中，軟骨下骨的一小部分被穿透，從而在骨髓和軟骨之間形成導(dǎo)管。在有缺陷的軟骨下方的骨頭上鉆一些小孔，以刺激骨髓，如所示圖1。骨髓中的干細(xì)胞有助于軟骨再生和缺損區(qū)域的愈合。 然而，MF更注重纖維軟骨的修復(fù)，而不是透明軟骨的實(shí)際再生。接受MF的患者在手術(shù)24個(gè)月后表現(xiàn)出關(guān)節(jié)功能下降。還有人擔(dān)心MF不會(huì)延遲OA的最終發(fā)病。

總體而言，MF 后軟骨的質(zhì)量和修復(fù)是可變且不一致的，這被認(rèn)為與有限的低數(shù)量干細(xì)胞 細(xì)胞 在刺激后侵入受損區(qū)域。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和對患者的臨床隨訪，很難追蹤 MF 修復(fù)的成功率并比較不同的臨床結(jié)果。

圖1：FDA批準(zhǔn)并實(shí)施的軟骨缺損再生療法示意圖總結(jié)。微骨折和自體移植等治療方法是當(dāng)前軟骨缺損修復(fù)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。 ACI和MACI已獲得FDA批準(zhǔn)，可用于大面積缺損修復(fù)。

其他金標(biāo)準(zhǔn)治療方法包括使用骨軟骨移植修復(fù)較大（>2平方厘米）的病變。自體移植物是從關(guān)節(jié)中承載力較小的部位取出的骨軟骨組織，然后移植到病變部位。通過用健康組織對患者的缺損進(jìn)行物理填充，希望該組織能與受損部位融合，從而修復(fù)缺損。

大量臨床研究表明，骨軟骨自體移植物對術(shù)后10年后的缺損修復(fù)有很好的療效，據(jù)報(bào)道，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是移植物能迅速融入缺損部位。從生理學(xué)角度看，膝關(guān)節(jié)機(jī)械壓力最低的部位位于股骨外側(cè)蹄弓或股骨切跡處，也是大多數(shù)骨栓的來源部位。為了降低供體部位的發(fā)病率，人們采用了一種被稱為鑲嵌成形術(shù)的替代技術(shù)，即從部分健康軟骨組織中提取多個(gè)小的塞子，然后將其放置在中小型缺損部位。使用患者自身組織并進(jìn)一步損傷膝關(guān)節(jié)的效果并不理想，因此有必要采用其他策略進(jìn)行缺損修復(fù)。圖1：描述了目前修復(fù)軟骨缺損的治療方法。

自體移植物的其他替代方案是骨軟骨同種異體移植物，通常在死亡后24小時(shí)內(nèi)從年輕捐贈(zèng)者身上采集，但保質(zhì)期較短，為28天，并且存在免疫原性問題。盡管如此，雖然這些治療方法已在臨床上取得成功，但組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的目標(biāo)是設(shè)計(jì)軟骨再生方法以克服這些限制。在過去的二十年里，人們對使用異種移植物修復(fù)骨軟骨缺損進(jìn)行了更多的研究。這里，來自豬膝蓋等動(dòng)物的骨軟骨栓經(jīng)過脫細(xì)胞處理，并在臨床前和臨床研究中顯示出功效，如圖2。

圖2.目前正在進(jìn)行軟骨缺損再生臨床試驗(yàn)的療法示意圖。植入式療法例如脫細(xì)胞支架和細(xì)胞片層技術(shù)被用于促進(jìn)軟骨再生并填充缺損。此外，來自脂肪組織的MSC分泌組和基質(zhì)血管部分已被關(guān)節(jié)內(nèi)注射到膝蓋中，希望這些?細(xì)胞的分泌組能夠產(chǎn)生在治療效果上。還研究了脫細(xì)胞ECM與基質(zhì)血管成分相結(jié)合等治療方法的組合。

最近的研究使用分化的干細(xì)胞 細(xì)胞形成軟骨ECM，將其去細(xì)胞化并整合天然軟骨細(xì)胞進(jìn)入脫細(xì)胞支架。人們注意到，與糖原合成酶激酶3β (GSK3β) 途徑相關(guān)的脫細(xì)胞基質(zhì)具有促軟骨形成作用，這對于調(diào)節(jié)細(xì)胞差異化。此外，這項(xiàng)研究證明了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，無論細(xì)胞來源如何，脫細(xì)胞ECM已成為用于軟骨組織工程的更普遍的天然基質(zhì)，并顯示出作為細(xì)胞的巨大潛力-免費(fèi)治療性，也在圖2。在下一節(jié)中，我們將重點(diǎn)討論無支架和基于基質(zhì)軟骨細(xì)胞的軟骨修復(fù)療法。

軟骨細(xì)胞療法：聚焦自體軟骨細(xì)胞植入

在過去的二十年中，更多的研究涉及注射自體軟骨細(xì)胞以促進(jìn)患者缺損處的軟骨再生。這稱為自體軟骨細(xì)胞植入（ACI）。ACI是一種解決軟骨缺陷（通常大于 2?cm）的兩步方法²。該程序的第一步是從膝蓋非承重部分的健康軟骨樣本中分離軟骨細(xì)胞。這些軟骨細(xì)胞隨后以單層形式擴(kuò)增并注射回患者的缺損處。第一代技術(shù)使用骨膜補(bǔ)片將軟骨細(xì)胞懸浮液隔離到缺損區(qū)域。然而，軟骨細(xì)胞肥大、再手術(shù)和清創(chuàng)率高等問題使得第二代ACI成為必要。

新一代的補(bǔ)片材料從骨膜補(bǔ)片轉(zhuǎn)變?yōu)镮型和III型豬膠原膜。這種方法仍然需要對缺損處進(jìn)行膜縫合，并導(dǎo)致一些懸浮液泄漏，但事實(shí)證明它確實(shí)更有效。

ACI后的組織成熟分為四個(gè)階段：植入階段（植入后0-6周）、過渡和增殖階段（6-12周）、早期階段成熟階段（12-26周）和晚熟階段（26周-3年）。在植入階段，軟骨細(xì)胞開始遷移到缺損處，然后在過渡和增殖階段填充缺損并形成軟軟骨。早期成熟被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞開始產(chǎn)生II型膠原和聚集蛋白聚糖從原始軟骨轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼒?jiān)固的軟骨的時(shí)間點(diǎn)。最后，在成熟后期，新組織填充了缺損區(qū)域，軟骨達(dá)到透明狀態(tài)。

盡管設(shè)備存在一些局限性，但ACI是一種治療軟骨損傷的有效方法，并且具有通過使用患者自身細(xì)胞而缺乏免疫原性等優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞。軟骨細(xì)胞滲漏和整體融入軟骨促進(jìn)了進(jìn)一步的改善。第三代 ACI 技術(shù)采用了稱為基質(zhì)輔助自體軟骨細(xì)胞植入 (MACI) 的基質(zhì)支架，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活力并模仿軟骨的機(jī)械特性。有關(guān)MACI的更多詳細(xì)信息將在下一節(jié)中討論。

軟骨細(xì)胞療法：基質(zhì)輔助自體軟骨細(xì)胞植入

MACI是目前最常見的治療軟骨缺損的細(xì)胞療法方法之一，已獲得批準(zhǔn)2016年獲得FDA批準(zhǔn)。從患者軟骨中分離軟骨細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，然后接種到由豬膠原蛋白膜組成的3D基質(zhì)上。這種成熟的醫(yī)療設(shè)備結(jié)合了基質(zhì)和細(xì)胞，可增強(qiáng)軟骨再生以填充軟骨缺陷。

由于軟骨細(xì)胞在整個(gè)膝蓋中的可用性有限，因此該裝置背后的想法是促進(jìn)軟骨細(xì)胞整合回天然軟骨，從而填補(bǔ)缺陷。 MACI適用于從單一到多重癥狀缺陷的一系列軟骨缺陷。膝關(guān)節(jié)常見的軟骨缺損包括：股骨外側(cè)髁、股骨內(nèi)側(cè)髁有或沒有骨損傷、髕骨和滑車缺損。

軟骨細(xì)胞療法：細(xì)胞片

組織工程學(xué)的進(jìn)步改變了MACI等方法，也改變了細(xì)胞片技術(shù)等新方法。為形成細(xì)胞片，可在熱敏組織培養(yǎng)器皿上培養(yǎng)細(xì)胞，并通過降低培養(yǎng)溫度移除細(xì)胞。細(xì)胞片培養(yǎng)的常見方法包括將細(xì)胞片組合在一起。例如，高橋（Takahashi）等人將三張軟骨細(xì)胞片擴(kuò)大并組合在一起，再培養(yǎng)7天，就形成了用于植入的分層細(xì)胞片。此外，關(guān)于腫瘤致病性的研究以及對基因突變和染色體異常出現(xiàn)的監(jiān)測，使細(xì)胞片技術(shù)得以在日本的臨床試驗(yàn)中應(yīng)用。

在臨床方面，Sato等人進(jìn)行的一項(xiàng)研究利用傳統(tǒng)手術(shù)干預(yù)治療膝關(guān)節(jié)OA，隨后進(jìn)行自體軟骨細(xì)胞片移植以促進(jìn)軟骨修復(fù)。該研究使用了八名患者的隊(duì)列，通過關(guān)節(jié)鏡活檢監(jiān)測術(shù)后12個(gè)月的治療效果。對患者活檢組織進(jìn)行了組織學(xué)分析，并通過基因表達(dá)分析對細(xì)胞片進(jìn)行了評估，以預(yù)測其臨床療效。圖像顯示，缺損區(qū)域的軟骨再生，膝關(guān)節(jié)排列保持一致。這項(xiàng)研究的結(jié)果支持了自體軟骨細(xì)胞片具有支持人體膝關(guān)節(jié)缺損部位透明樣軟骨再生的潛力這一觀點(diǎn)。

為了克服自體軟骨的局限性，利用干細(xì)胞來生成軟骨已變得越來越普遍軟骨細(xì)胞擴(kuò)張。在下一節(jié)中，我們將進(jìn)一步擴(kuò)展不同的干細(xì)胞療法用于軟骨修復(fù)。

干細(xì)胞療法

干細(xì)胞是一種常見且豐富的細(xì)胞類型用于多種器官和病理的細(xì)胞療法。在本節(jié)中，我們將討論干細(xì)胞療法的用途軟骨缺陷并研究OA中的干細(xì)胞療法。

除患者自身骨髓來源的干細(xì)胞外，其他干細(xì)胞來源正在被研究作為一種細(xì)胞療法用于軟骨再生。值得注意的是，表格1描述了不同的細(xì)胞來源及其對軟骨再生的優(yōu)點(diǎn)和局限性。在本節(jié)中，我們將討論間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MSC)、MSC 分泌組和iPSC。

間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞可以很容易地來源于臍帶、骨髓、脂肪組織，并且具有自我更新和分化成多種組織的能力。更重要的是，間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為軟骨細(xì)胞和骨的多潛能，因此可用于軟骨和骨軟骨缺損。具體而言，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）在與營養(yǎng)因子（如轉(zhuǎn)化生長因子-β3（TGF- β3））配伍后，顯示出關(guān)節(jié)軟骨再生的潛力。其他研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中有助于軟骨細(xì)胞的表型維持，這表明間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)可能是自體軟骨細(xì)胞植入的一種新方法。

臨床研究顯示，在OA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可改善軟骨狀況，且無嚴(yán)重影響。Muthu等人進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析，調(diào)查了目前文獻(xiàn)中的隨機(jī)對照試驗(yàn)，以評估用于治療OA的間充質(zhì)干細(xì)胞的最有效范圍。由于臨床試驗(yàn)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的療效結(jié)果各不相同。建議進(jìn)行劑量遞增臨床試驗(yàn)，以更好地規(guī)范干細(xì)胞在治療OA中的應(yīng)用。

雖然間充質(zhì)干細(xì)胞具有作為軟骨再生細(xì)胞源的潛力，但它們也分泌細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外囊泡等旁分泌因子，這些因子被認(rèn)為也能促進(jìn)愈合和再生。大量蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌50-100納米的細(xì)胞外囊泡，即外泌體，可對受損組織產(chǎn)生治療作用。

張等人的一項(xiàng)研究分離了人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體，每周對大鼠骨軟骨缺損進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。結(jié)果表明，外泌體治療12周后，與PBS對照組形成的纖維組織相比，缺損部位的軟骨和軟骨下骨完全恢復(fù)，并具有透明樣特征。

總的來說，這些研究表明MSC分泌組具有促進(jìn)體內(nèi)軟骨再生的潛力體內(nèi)然而，在應(yīng)用于臨床之前，還需要開展更多工作來充分了解MSC分泌組促進(jìn)再生的機(jī)制。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

與胚胎干細(xì)胞的多能性相似，iPSCs也是由山中伸彌（Shinya Yamanaka）首先證明的經(jīng)過去分化過程的體細(xì)胞產(chǎn)生的。iPSCs的來源包括血液和成纖維細(xì)胞，其中分離出的細(xì)胞經(jīng)慢病毒改變后可表達(dá)常見的胚胎標(biāo)志物，如八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）、SRY-box2（Sox2）、克魯珀類因子4（Klf4）和c-myc。如前所述，與間充質(zhì)干細(xì)胞的多能性相比，iPSCs具有多能性，這意味著iPSCs可以分化成任何主要生殖層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。這些細(xì)胞具有很高的自我更新潛能，使其成為透明軟骨的理想細(xì)胞來源。由于軟骨組織屬于中胚層，iPSCs可首先分化為間充質(zhì)祖細(xì)胞（iMPCs），然后再分化為軟骨。

中村（Nakamura）等人進(jìn)行的一項(xiàng)研究使用了iPSC衍生的神經(jīng)嵴細(xì)胞，并將其誘導(dǎo)到類似間充質(zhì)干細(xì)胞的狀態(tài)。細(xì)胞分化后形成球體，用于生物打印。雖然這些方法尚未應(yīng)用于臨床，但人們正在利用iPSCs進(jìn)行軟骨缺損再生的進(jìn)一步研究。iPSCs可應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療，因?yàn)樗鼈兛梢詠碜曰颊弑旧恚瑥亩拗屏嗣庖叻磻?yīng)。然而，在臨床應(yīng)用之前，必須了解iPSC分化為軟骨細(xì)胞的復(fù)雜性，以避免倫理問題。

了解OA和先前存在的關(guān)節(jié)疾病的多個(gè)方面對于基于患者的治療開發(fā)是必要的。此外，了解患者OA的原因，如機(jī)械關(guān)節(jié)衰竭、炎癥應(yīng)激和代謝應(yīng)激，可以為這些患者闡明最佳治療方法。對軟骨再生的再生級聯(lián)缺乏了解導(dǎo)致治療方法不一致，從而導(dǎo)致結(jié)果不一致。有人建議，為了減輕這些結(jié)果，未來的試驗(yàn)應(yīng)該測試具體的假設(shè)，并重點(diǎn)關(guān)注對軟骨生物學(xué)和再生的機(jī)制理解，以便為治療的開發(fā)提供有價(jià)值的信息。

未來方向：合成生物學(xué)在軟骨再生方面的潛力

在癌癥等其他疾病狀態(tài)下，細(xì)胞已利用合成生物學(xué)積極改造以靶向特定受體。例如，嵌合抗原受體T細(xì)胞（CART 細(xì)胞）已被設(shè)計(jì)用于靶向腫瘤相關(guān)抗原受體。 就與OA相關(guān)的人口老齡化而言，存在i) 缺乏軟骨細(xì)胞再生潛力和ii) 稱為衰老的細(xì)胞周期停滯的常見發(fā)作，這會(huì)導(dǎo)致慢性低-通過衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的出現(xiàn)來確定炎癥的分級狀態(tài)?？梢圆捎煤铣蓱?yīng)用來增加軟骨細(xì)胞的再生潛力，并通過合成遺傳網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建治療過程，本質(zhì)上是創(chuàng)建“工程軟骨細(xì)胞”，如圖3所示了。

圖3：用于軟骨修復(fù)的多種細(xì)胞療法。該示意圖描繪了多種細(xì)胞類型及其在軟骨缺損修復(fù)中的用途。在這里，我們從ACI和MACI中看到的自體軟骨細(xì)胞開始。然后我們轉(zhuǎn)向干細(xì)胞，主要是MSC和iPsc，它們可以分化為軟骨細(xì)胞并用于IA注射和基質(zhì)。細(xì)胞療法的未來主要集中在用于軟骨再生的合成工程軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞衍生的軟骨細(xì)胞。

結(jié)論

在這篇綜述中，我們討論了目前軟骨再生的臨床方法，主要針對45歲以下的患者。自體軟骨細(xì)胞移植和基質(zhì)自體軟骨細(xì)胞移植已證明在軟骨缺損方面取得了成功，但適合該手術(shù)的患者范圍有限。此外，目前還沒有任何DMOAD獲得FDA批準(zhǔn)，針對骨關(guān)節(jié)炎患者的干細(xì)胞療法仍處于早期臨床試驗(yàn)階段。

了解先前存在的關(guān)節(jié)病理學(xué)的影響對于開發(fā)治療方法是必要的。 間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是軟骨再生的無限細(xì)胞來源，但也有其自身的局限性，例如成本、倫理和表型挑戰(zhàn)。采用合成生物學(xué)技術(shù)來增強(qiáng)軟骨再生可能有助于解決骨關(guān)節(jié)炎缺乏有前景的細(xì)胞療法的問題。

參考資料：Meagan J. Makarczyk (2023) Cell Therapy Approaches for Articular Cartilage Regeneration, Organogenesis, 19:1, DOI: 10.1080/15476278.2023.2278235

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