腎臟疾病是世界范圍內(nèi)的主要健康問題。盡管藥物治療取得了進(jìn)展，但它們只能減緩腎臟疾病的進(jìn)展。因此，人們開始探索利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的潛在策略。再生策略有兩個不同的方向，利用干細(xì)胞進(jìn)行全腎重新制造和干細(xì)胞治療。全腎重新制造策略包括：

• 1）脫細(xì)胞支架技術(shù)，
• 2）基于工程技術(shù)的3D生物打印，
• 3）腎臟類器官制造，
• 4）囊胚嵌合技術(shù)，
• 5）器官發(fā)生微環(huán)境方法。

同時，干細(xì)胞治療策略包括

• 1）注射干細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、腎元祖細(xì)胞、成體腎干細(xì)胞和多譜系分化應(yīng)激細(xì)胞，
• 2）注射這些干細(xì)胞分泌的保護因子，包括生長因子、趨化因子和含有microRNA、mRNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡。

在過去的幾十年里，這些策略取得了顯著的進(jìn)步。

本文，我們回顧了利用干細(xì)胞治療腎病進(jìn)行腎臟再生的潛在策略的最新進(jìn)展，以及未來可能在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。

介紹

全球范圍內(nèi)慢性腎臟病 (CKD) 患者的發(fā)病率持續(xù)上升，CKD已成為日益嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)。終末期腎臟病 (ESKD) 需要腎臟替代治療，包括血液透析、腹膜透析和腎移植。2010年，有261萬人接受了透析或腎移植，預(yù)計到2030年這一數(shù)字將翻一番。由于供體數(shù)量少且移植后需服用免疫抑制藥物，只有少數(shù)人能夠接受腎移植。

同時，透析治療并不能完全取代腎臟的作用，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，并因心血管疾病等并發(fā)癥導(dǎo)致預(yù)后不良。盡管近年來技術(shù)取得了進(jìn)展，包括可穿戴人工腎臟和生物人工腎小管輔助裝置 (RAD)，但仍然難以補償整個腎臟功能。因此，建立腎臟再生療法非常重要，而使用干細(xì)胞的策略可能是實現(xiàn)這一目標(biāo)的潛在選擇之一。

利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的策略有兩個方向：“重建”和“修復(fù)”。其中“重建”策略包括利用干細(xì)胞從頭制造腎臟并通過移植進(jìn)行替換，“修復(fù)”策略包括誘導(dǎo)原生腎臟修復(fù)系統(tǒng)（圖1）。

從頭腎臟制造的策略有幾種，包括

• 1）脫細(xì)胞支架技術(shù)，
• 2）基于工程技術(shù)的3D生物打印，
• 3）腎臟類器官制造，
• 4）囊胚互補技術(shù)，
• 5）器官發(fā)生生態(tài)位法。

誘導(dǎo)原生腎臟修復(fù)系統(tǒng)包括

• 1）注射干細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、腎元祖細(xì)胞（NPCs）、成體腎干細(xì)胞和多譜系分化應(yīng)激（Muse）細(xì)胞，
• 2）注射干細(xì)胞分泌的保護因子。在過去的幾十年里，兩個方向都取得了顯著的循序漸進(jìn)的發(fā)展。

在這里，我們總結(jié)了目前利用干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生的潛在策略，以及它們在腎臟疾病患者臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。

新腎制造的方法有哪些？

脫細(xì)胞腎臟

脫細(xì)胞策略是從頭制造腎臟的選項之一。該方法使用洗滌劑，例如十二烷基硫酸鈉 (SDS) 和 Triton X-100，去除整個器官中的細(xì)胞，然后注入特定細(xì)胞（例如干細(xì)胞），使其分化為成熟細(xì)胞并與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 一起植入脫細(xì)胞支架中。這一概念首先應(yīng)用于心臟，然后應(yīng)用于肺、肝臟和腎臟。

對于腎臟，將小鼠胚胎干細(xì)胞 (ES) 注射到大鼠脫細(xì)胞腎臟中，在那里觀察到分化為ES細(xì)胞衍生的血管、腎小球和腎小管。另一個研究小組也應(yīng)用了這一概念，將小鼠ES細(xì)胞接種到來自腎動脈的去細(xì)胞大鼠腎臟上，結(jié)果顯示接種細(xì)胞在血管系統(tǒng)和腎小球毛細(xì)血管中分布均勻，沒有凋亡跡象。還通過將來自腎動脈的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 注射到去細(xì)胞大鼠腎臟和來自輸尿管的大鼠新生腎細(xì)胞中，研究了再細(xì)胞化腎臟的尿液產(chǎn)生情況。

3D生物打印

3D生物打印的應(yīng)用是從頭制造腎臟的另一種方法。生物打印是一種技術(shù)，涉及逐層精確沉積生物墨水（通常是含有細(xì)胞的水凝膠）或生物材料墨水（不含細(xì)胞），以構(gòu)建復(fù)雜的組織或器官。有幾篇關(guān)于耳朵等組織構(gòu)建的報道，但尚未報道從頭制造整個腎臟。整個腎臟的構(gòu)建面臨多項挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞類型和生物材料的選擇，以及腎臟結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其細(xì)胞類型的多樣性。盡管如此，據(jù)報道取得了重要的一步，即利用 3D 生物打印技術(shù)生成了血管化結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)以及近端上皮細(xì)胞。

同一研究小組進(jìn)一步開發(fā)了一種具有內(nèi)皮和上皮通道的雙通道腎臟模型。他們使用明膠和纖維蛋白的混合物作為ECM材料，并在生物打印后對細(xì)胞進(jìn)行后接種。

此外，該產(chǎn)品可能對體外藥物腎毒性測試和疾病建模有用。3D生物打印技術(shù)還用于腎臟類器官模型，以進(jìn)行高通量藥物腎毒性分析，其中iPS細(xì)胞衍生的類器官是通過3D生物打印方法生產(chǎn)的，具有更高的可重復(fù)性和更短的時間范圍。

類器官

利用自組織技術(shù)從多能干細(xì)胞 (PSC) 構(gòu)建腎臟器官是一項重大挑戰(zhàn)。一般而言，從PSC進(jìn)行自組織誘導(dǎo)應(yīng)基于對腎臟發(fā)育的了解。

腎單位由三種類型的祖細(xì)胞組成：NPC、輸尿管芽 (UB) 和基質(zhì)祖細(xì)胞。NPC通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化形成管狀上皮細(xì)胞和腎小球。UB通過多個分支分化為集合管?；|(zhì)祖細(xì)胞分化為間質(zhì)細(xì)胞。多個研究小組已報道通過從PSC分化誘導(dǎo)NPC。Taguchi等人通過多個步驟結(jié)合多種生長因子從iPS細(xì)胞中建立了NPC。此外，通過將NPC與小鼠胚胎的脊髓一起培養(yǎng)，他們成功創(chuàng)建了包含3D腎小球和腎小管的腎臟結(jié)構(gòu)。其他研究小組也建立了使用PSC衍生的NPC構(gòu)建3D腎元（包括腎小球和腎小管）的方案。

然而，通過將類器官移植到小鼠體內(nèi)，構(gòu)建的類器官連接了宿主的血管網(wǎng)絡(luò)。盡管取得了這些逐步的發(fā)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。

• 首先，目前報道的類器官尺寸太小，無法產(chǎn)生足夠的尿液來維持體內(nèi)平衡。
• 其次，需要與大血管進(jìn)行運輸。有幾個研究小組報道了通過將腎類器官移植到腎包膜下來構(gòu)建血管系統(tǒng)，但這些方法都相當(dāng)簡單。盡管如此，最近一項利用微流控芯片上的流動創(chuàng)建腎類器官的研究顯示，血管網(wǎng)絡(luò)擴張，足細(xì)胞和腎小管區(qū)室成熟，細(xì)胞極性和成體基因表達(dá)水平更高，表明腎類器官中血管系統(tǒng)的進(jìn)展。
• 第三，仍然需要從 PSC 建立基質(zhì)祖細(xì)胞。
• 第四，類器官的成熟仍然是一個重要問題。Taguchi等人。報道稱，所制備的腎類器官在7天培養(yǎng)中與E15.5腎臟相當(dāng)。除了通過PSC制造外，另有報道稱可從成體腎干細(xì)胞產(chǎn)生腎類器官。

通過在Matrigel中培養(yǎng)具有多種生長因子的成體腎干細(xì)胞簇，細(xì)胞簇分化為腎小球、小管上皮細(xì)胞和集合管，表明存在具有分化為NPC和UB譜系能力的成體腎干細(xì)胞。

總之，類器官技術(shù)可能有助于探索特定疾病和/或治療機制，以及治療藥物篩選。

囊胚互補

囊胚補充法是將PSC植入部分組織/器官缺陷的動物未分化生殖細(xì)胞中，并從植入的PSC中衍生出缺陷部分的方法。通過將此策略應(yīng)用于Pdx1缺陷的胰腺生成障礙嚙齒動物模型，創(chuàng)建了PSC衍生的胰腺。建立的胰腺主要來自植入的PSC。此策略也應(yīng)用于腎臟。通過將ES細(xì)胞注射到缺乏Sall1基因（該基因?qū)τ诤竽I間充質(zhì)發(fā)育至關(guān)重要）的小鼠囊胚中，Usui等人成功實現(xiàn)了PSC衍生的腎臟的生產(chǎn)；腎小球和腎小管細(xì)胞來自 ES 細(xì)胞，而其他集合管和血管細(xì)胞則來自宿主。

此外，還報道了跨物種產(chǎn)生。Goto等人在跨物種實驗中將小鼠來源的ES細(xì)胞移植到Sall1缺陷大鼠體內(nèi)，成功制備了小鼠PSC來源的腎臟，其中腎小球和腎小管上皮完全由小鼠PSC來源的細(xì)胞組成，輸尿管-膀胱連接處形成正常，這表明可以在異種宿主中使用該策略，例如使用人PSC。

器官生態(tài)位方法

器官微環(huán)境法利用后期胚胎腎臟的器官微環(huán)境，應(yīng)用囊胚補充的概念，將器官祖細(xì)胞植入器官發(fā)育的部位和時間，并在生長中的胎兒系統(tǒng)中進(jìn)行離體培養(yǎng)以分化為器官。

干細(xì)胞治療

干細(xì)胞給藥

干細(xì)胞注射是誘導(dǎo)再生機制的一種選擇。植入干細(xì)胞有兩種機制：通過遷移、分化和植入到受損部位替換受損組織，以及植入干細(xì)胞的旁分泌作用。

干細(xì)胞注射的優(yōu)勢在于其歸巢效應(yīng)；植入的干細(xì)胞遷移到受損組織并可能有助于局部旁分泌作用。

有大量已發(fā)表的報告表明MSC靜脈注射對嚙齒動物急性腎損傷 (AKI) 模型（由藥物或缺血/再灌注 (I/R) 損傷引起）和CKD模型（例如5/6腎切除術(shù)、糖尿病腎病和單側(cè)輸尿管梗阻）的再生作用。雖然據(jù)報道MSC衍生細(xì)胞植入是一種直接替代機制，但證據(jù)表明，主要的營養(yǎng)作用可歸因于旁分泌作用。MSC可從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織和臍帶。盡管MSC來源可能存在異質(zhì)性，但據(jù)報道，每種MSC都具有腎保護作用。

關(guān)于腎臟特異性干細(xì)胞，Kitamura等人建立了成體腎臟干細(xì)胞，通過替換受損組織，施用這些細(xì)胞可改善 I/R誘發(fā)的AKI模型中的腎功能。此外，有幾份報告證明，在藥物或I/R誘發(fā)的急性腎損傷和5/6腎切除術(shù)誘發(fā)的慢性腎病中，PSC衍生的NPC治療可以保留腎功能。

此外，據(jù)報道，Muse細(xì)胞（可從各種器官收集的非致瘤性內(nèi)源性多能樣干細(xì)胞）的治療可通過歸巢到受損腎小球并分化為腎小球細(xì)胞來改善阿霉素誘導(dǎo)的局灶節(jié)段性腎小球硬化模型。

總之，干細(xì)胞治療腎病可能通過直接和間接機制對急性腎損傷和慢性腎病均具有治療潛力。

干細(xì)胞分泌組的管理

由于干細(xì)胞治療的旁分泌作用可能在干細(xì)胞治療中發(fā)揮主要作用，因此干細(xì)胞的分泌組和再生機制備受關(guān)注。MSCs的分泌組以及再生機制已得到很好的總結(jié)。先前的報告顯示，旁分泌機制包括細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥、血管生成和腎小管細(xì)胞去分化。人們認(rèn)為，各種因素協(xié)同作用來介導(dǎo)這些機制。

MSCs可能分泌生長因子、趨化因子和含有微小RNA (miRNA)、mRNA 和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡 (EVs) 。作為生長因子，MSC分泌肝細(xì)胞生長因子 (HGF)、表皮生長因子樣生長因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF) 和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)，據(jù)報道，這些因子均具有腎臟保護作用。

此外，越來越多的證據(jù)表明，來自MSC的含有EV的miRNA是干細(xì)胞治療中的重要貢獻(xiàn)者。來自MSC的營養(yǎng)性miRNA包括miR-21、miR-199、Let-7家族和miR-30，它們可能通過與3′-UTR結(jié)合而沉默其靶基因。還有報道稱，這些分泌蛋白組可能受到多種刺激的修飾，包括缺氧、炎癥刺激和改變的培養(yǎng)條件。由于EVs可以作為一種天然的藥物輸送系統(tǒng)，將多種因子高穩(wěn)定性地運送到遠(yuǎn)處的器官，因此利用特定的miRNAs來治療來自干細(xì)胞的EVs可能是另一個有前途的選擇。

結(jié)論

這里，我們總結(jié)了干細(xì)胞應(yīng)用的兩個方向“重建”和“修復(fù)”。對于這兩種方法，臨床應(yīng)用仍存在一些挑戰(zhàn)。關(guān)于“重建”方法，需要血管侵入腎臟、腎臟大小足以產(chǎn)生尿液、誘導(dǎo)不顯示尿蛋白的足細(xì)胞以及通過尿液流入腎小管并重新吸收重要物質(zhì)的詳細(xì)機制產(chǎn)生腎臟。

由于結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，腎臟的重建與其他器官相比很困難。然而，考慮到過去幾十年的快速發(fā)展，“重建”技術(shù)在未來可能是可能的。

關(guān)于“修復(fù)”，我們?nèi)匀恍枰U明腎臟的再生機制，以便我們可以使用干細(xì)胞或干細(xì)胞介導(dǎo)的分泌體激活這些機制。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但使用干細(xì)胞進(jìn)行再生治療是一種有前途的腎保護策略。

參考資料：Tsuji K, Kitamura S and Wada J (2022) Potential Strategies for Kidney Regeneration With Stem Cells: An Overview.?Front. Cell Dev. Biol.?10:892356. doi: 10.3389/fcell.2022.892356

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