人羊膜上皮細(xì)胞(hAEC)因具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌作用、在體內(nèi)不形成畸胎瘤等特性,在許多疾病的研究中顯示出良好的治療效果。

作用堪比全能干細(xì)胞，重新認(rèn)識人羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞特性及其治療應(yīng)用

簡介：人羊膜上皮細(xì)胞 (hAEC) 來源于受精后第8天左右從外胚層分化而來的羊膜外胚層。羊膜外胚層的細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)錄組與外胚層有明顯不同。隨著分化和擴(kuò)增，羊膜外胚層逐漸與外胚層分離，形成充滿羊水的羊膜腔，此結(jié)構(gòu)稱為羊膜囊。

羊水發(fā)生發(fā)生在原條形成之前，原條形成是原腸胚形成起始的標(biāo)志，這使得羊膜外胚層細(xì)胞成為原始的胚外細(xì)胞之一。hAEC緊密堆積為單層，位于羊膜的最內(nèi)層，直接與羊水接觸。

據(jù)報道，從妊娠早期羊膜中分離的hAEC表達(dá)TRA1-60、TRA1-81、SSEA3和SSEA4等多能性標(biāo)志，這些標(biāo)志在妊娠期間逐漸丟失。盡管許多臨床研究表明hAEC在多種疾病的治療中具有良好的潛力，但其具體的細(xì)胞生物學(xué)特征和治療機(jī)制仍然不清楚。

此外，研究表明hAEC缺乏端粒酶活性，增殖能力有限，阻礙了其作為細(xì)胞產(chǎn)品在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用和進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化。為了解決這些問題，全面了解hAEC至關(guān)重要，包括細(xì)胞特性、內(nèi)在增殖能力和治療潛力。

01人羊膜上皮細(xì)胞的來源

人羊膜上皮細(xì)胞（hAECs）的來源可以總結(jié)如下：

• 胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化：hAECs源自胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化發(fā)育而成。這些細(xì)胞位于胎盤羊膜的最內(nèi)層，由受精卵發(fā)育至第8天的囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)分化而來。
• 羊膜的構(gòu)成：人羊膜是附著在胎盤胎兒面的半透明無血管薄膜，由5層結(jié)構(gòu)組成，包括上皮層、基底膜、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層（后三層統(tǒng)稱為基質(zhì)層），其中上皮層即為hAECs所在的層。
• 囊胚期上胚層分化：hAECs由胚胎發(fā)育第8-9天的囊胚期上胚層分化而來，其原始祖性僅次于源自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎干細(xì)胞。

• 羊膜腔的形成：在囊胚植入子宮內(nèi)膜間質(zhì)后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化為兩層：上胚層和下胚層。上胚層是三個胚層的起源，最終將分化為胚胎。隨后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和鄰近滋養(yǎng)層細(xì)胞之間逐漸形成一空腔，即羊膜腔。位于羊膜腔內(nèi)的細(xì)胞被稱為羊膜母細(xì)胞，即hAECs的前體細(xì)胞。

羊膜外胚層被認(rèn)為是原始羊膜上皮細(xì)胞，在植入前后由外胚層分化而來。隨后，原條將從非羊膜起源的外胚層衍生而來，這代表三個胚胎胚層和器官發(fā)生的開始（圖1A）。

（A）受精卵經(jīng)歷快速分裂。在桑葚胚階段，細(xì)胞表現(xiàn)出不同的分裂速度，導(dǎo)致形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM) 和滋養(yǎng)外胚層。

（B）人羊膜由5層組成：1）上皮單層，2）基底膜層，3）致密層，4）成纖維細(xì)胞層和5）海綿層。

羊膜是一種重要的胚胎外組織，是動物從水生環(huán)境進(jìn)化到陸生環(huán)境的重要里程碑。羊膜為胎兒提供機(jī)械保護(hù)，并分泌細(xì)胞因子和激素，促進(jìn)胚胎發(fā)育。

羊膜上皮細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，如糖蛋白和膠原，構(gòu)成了底層基底膜。羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間質(zhì)細(xì)胞主要分別位于上皮細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層。這兩種細(xì)胞有不同的來源。羊膜上皮細(xì)胞來源于羊膜外胚層，而羊膜間充質(zhì)細(xì)胞則來源于胚外中胚層，后者發(fā)育在羊膜上皮細(xì)胞之后。作為源自羊膜的兩種主要細(xì)胞類型，這兩種細(xì)胞都具有免疫原性低、不致瘤、倫理考慮有限等優(yōu)點(diǎn)。

表1列出了hAECs和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSCs）的特征標(biāo)記。

02人羊膜上皮細(xì)胞的特點(diǎn)

人羊膜上皮細(xì)胞（hAECs）具有以下特點(diǎn)：

• 多能性：hAECs具有表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物的特點(diǎn)和較全面的多向分化潛能，能夠向三胚層分化。

• 免疫調(diào)節(jié)性：hAECs具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，移植后不易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

• 無致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，這決定了其在體外擴(kuò)增不超過6代，避免了干細(xì)胞臨床應(yīng)用的致瘤性。

• 低免疫原性：hAECs具有低免疫原性，不表達(dá)MHC II類抗原和共刺激分子，減少了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。

• 神經(jīng)細(xì)胞特性：hAECs能合成和分泌多巴胺，表達(dá)多巴胺受體D1和D2，以及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF、NT-3、NGF等)和其他神經(jīng)遞質(zhì)與調(diào)質(zhì)，具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。

• 分泌多種因子：hAECs能分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子，促使宿主自身干細(xì)胞功能的活躍及自身修復(fù)。

• 抗氧化自由基能力：hAECs內(nèi)含有多種分化酶，提高人體抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等。

• 易于獲取且無倫理爭議：hAECs來源于胎盤，胎盤通常在分娩后作為醫(yī)療廢棄物丟棄，容易獲得，不涉及倫理問題。

• 促進(jìn)血管生成和傷口愈合：hAECs具有調(diào)節(jié)血管形成的能力，被廣泛用于組織工程，以增加血液灌注并促進(jìn)傷口愈合。

• 抗腫瘤作用：hAECs對某些腫瘤如上皮性卵巢癌細(xì)胞具有抑制作用，可能通過抗增殖和促凋亡，以及調(diào)節(jié)血管生成和細(xì)胞周期等，抑制腫瘤生長和侵襲。

這些特點(diǎn)使得hAECs在干細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。

03人羊膜上皮細(xì)胞的表征與擴(kuò)增

盡管許多臨床研究已證實hAEC具有治療作用，但目前的體外培養(yǎng)擴(kuò)增系統(tǒng)限制了其應(yīng)用。原代hAEC的產(chǎn)量和生物學(xué)特性受產(chǎn)婦身體狀況、胎盤大小和質(zhì)量、不同羊膜部位的來源、妊娠階段、分離和保存程序等多種因素影響。從羊膜中分離的hAEC平均數(shù)量約為1×10^8，而單次治療通常需要0.5~1×10^8之間的數(shù)量，這導(dǎo)致同質(zhì)細(xì)胞可能不足以對同一患者進(jìn)行多次治療。

因此，獲得符合良好臨床實驗室規(guī)范 (GCLP) 標(biāo)準(zhǔn)的hAEC已成為一項絕對挑戰(zhàn)。開發(fā)一種足以在體外擴(kuò)增hAEC的系統(tǒng)需要了解hAEC的特性及其增殖機(jī)制。

04人羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物

人羊膜上皮細(xì)胞（hAEC）的細(xì)胞標(biāo)志物包括多種胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物和多潛能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。以下是一些關(guān)鍵的hAEC細(xì)胞標(biāo)志物：

• 胚胎干細(xì)胞表面抗原：hAEC表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面抗原，包括SSSEA-3和SSSEA-4，以及腫瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81。
• 多潛能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子：hAECs還表達(dá)多潛能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等。
• 其他抗原：hAECs還表達(dá)ATP流出泵的ATP結(jié)合暗盒超級家族成員之一的ABCG2/BCRP、CD9、CD24、上皮鈣黏蛋白、整合素α6和β、肝細(xì)胞生長因子結(jié)合受體（c-met）等。
• 不表達(dá)的標(biāo)記物：hAECs不表達(dá)CD34（造血干細(xì)胞及內(nèi)表干細(xì)胞表面標(biāo)記）、SSSEA-1、CD133（造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面標(biāo)記），弱表達(dá)c-kit(CD117)和CC趨化因子受體（CRR4）。
• 上皮標(biāo)志物：hAECs表達(dá)上皮標(biāo)志物角蛋白CK19，不表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白。
• 其他表達(dá)的分子：hAECs表達(dá)胚胎干細(xì)胞相關(guān)分子CD9, E-cadherin, PODXL, SSEA-4, SOX2, SSEA-1, Nanog, Oct-3/4。

這些標(biāo)志物有助于識別和區(qū)分hAECs，并在研究和臨床應(yīng)用中具有重要意義。

05人羊膜上皮細(xì)胞的增殖機(jī)制

人羊膜上皮細(xì)胞（hAECs）的增殖機(jī)制涉及多個方面，以下是一些關(guān)鍵點(diǎn)：

• EGFR/ERK1信號軸的調(diào)節(jié)作用：研究表明，hAECs可以通過激活EGFR/ERK1信號軸來促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并抑制其凋亡。這表明hAECs可能通過類似的機(jī)制影響自身的增殖。
• 抗氧化自由基能力：hAECs內(nèi)含有多種分化酶，這些酶可以提高人體抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等，這些活性因子可能間接影響細(xì)胞的增殖和代謝。
• 旁分泌因子的作用：hAECs能夠分泌多種營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)因子，這些因子可以重塑受損組織中的局部微環(huán)境，從而修復(fù)受損細(xì)胞和組織，并且這些營養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子可能在血管生成、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程中起作用。這些旁分泌因子可能對hAECs的增殖有直接或間接的影響。
• 自我更新和分化潛能：hAECs表達(dá)多能干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，例如OCT-4、SOX-2和Nanog，這些因子對于維持其自我更新和分化潛能至關(guān)重要，也可能影響其增殖能力。
• 無致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，這決定了其在體外擴(kuò)增不超過6代，避免了干細(xì)胞臨床應(yīng)用的致瘤性，這可能與其增殖機(jī)制有關(guān)，即它們在一定代數(shù)后會自然停止增殖。

這些機(jī)制共同作用，可能影響hAECs的增殖和維持其功能。

06細(xì)胞療法的現(xiàn)狀

干細(xì)胞療法近年來已成為再生醫(yī)學(xué)的重要一環(huán)。常用的細(xì)胞類型包括多能干細(xì)胞、胚胎外組織來源的細(xì)胞和成體干細(xì)胞。在干細(xì)胞臨床應(yīng)用中，造血干細(xì)胞（HSC）移植占據(jù)主導(dǎo)地位，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）研究則位居第二。

hAEC是形態(tài)上皮細(xì)胞，具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。此外，hAEC缺乏端粒酶活性和可持續(xù)細(xì)胞分裂的潛力，使它們具有低致瘤性。因此，hAEC被認(rèn)為是細(xì)胞治療的有希望的候選者（圖2）。

盡管對于hAEC治療疾病的分子機(jī)制存在一些不確定性，無論是體內(nèi)植入和分化，還是調(diào)節(jié)生化反應(yīng)和細(xì)胞對損傷的反應(yīng)，Wallace團(tuán)隊的工作已經(jīng)清楚地證明hAEC無需植入或分化即可發(fā)揮修復(fù)作用。他們認(rèn)為hAEC修復(fù)肺損傷的主要機(jī)制可能是向周圍組織發(fā)出旁分泌信號以減少促炎和促纖維化介質(zhì)。在腦缺血、帕金森病、脊髓損傷和傷口愈合方面的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

07

5項關(guān)于人羊膜上皮細(xì)胞“從實驗室到臨床”的研究

1981年，Akle等首次分離出原代hAEC，并將其移植到7名志愿者的上臂皮下。4周后，研究人員觀察到所有志愿者的血液中均沒有檢測到HLA抗體，其中2名志愿者也沒有出現(xiàn)淋巴細(xì)胞反應(yīng)，這表明移植hAEC不會引起急性免疫排斥反應(yīng)。

此后，利用hAEC進(jìn)行細(xì)胞治療已成為一種新興的疾病治療方法。此后，許多研究顯示hAEC在臨床前治療中具有令人滿意的效果，但在臨床研究方面卻很少有結(jié)果。

截至2024年11月，數(shù)據(jù)庫中列出了25項臨床試驗（ClinicalTrials.gov、Anzctr.org.au 等），這些試驗使用“人羊膜上皮細(xì)胞”作為治療各種疾病的生物干預(yù)措施（表2），最有前景的包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病和組織修復(fù)。

人羊膜上皮細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病

大量研究表明，hAEC具備神經(jīng)元的某些生化特性，盡管具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛力。hAEC在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面最普遍接受的觀點(diǎn)與其旁分泌信號有關(guān)。已證明hAEC能夠合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子和神經(jīng)遞質(zhì)，如兒茶酚胺和多巴胺，這些物質(zhì)有助于促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的再生。hAEC還能分泌抗炎因子，有助于減少神經(jīng)炎癥，改善細(xì)胞微環(huán)境，減緩疾病的進(jìn)展過程。

越來越多的證據(jù)表明，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型中使用hAEC可以減少細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損神經(jīng)元，重建受損神經(jīng)連接。有研究表明，hAEC有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞療法的候選對象。本文，我們將重點(diǎn)介紹hAEC在帕金森病和阿爾茨海默病中的研究。

人羊膜上皮細(xì)胞治療帕金森病

帕金森病（PD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。迄今為止，PD仍無法治愈，目前可用的臨床治療旨在減緩疾病進(jìn)展和緩解運(yùn)動癥狀。在過去的幾十年里，除了傳統(tǒng)的藥物和手術(shù)治療外，越來越多的新療法被用于治療PD。細(xì)胞療法在這些療法中發(fā)揮了重要作用并取得了顯著的成果。

大量動物研究表明hAEC在PD治療中具有良好的治療潛力。

• Zhang等進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，hAECs立體定向移植至PD小鼠紋狀體，可促進(jìn)神經(jīng)突和軸突纖維的生長，抑制受損多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，有助于維持神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時，hAECs條件培養(yǎng)基也可促進(jìn)體外神經(jīng)突的生長，提示hAECs可能通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)。

盡管許多研究表明hAEC能夠緩解PD癥狀，但其潛在機(jī)制尚不清楚。已證明hAEC分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 (CNTF)、制瘤素M (OSM) 和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 可在神經(jīng)突生長、軸突生長、突觸可塑性和神經(jīng)細(xì)胞表型方面促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生。這些研究提供了一種觀點(diǎn)，即hAEC有望成為一種新的PD治療方法。

人羊膜上皮細(xì)胞治療阿爾茨海默病

阿爾茨海默病 (AD) 是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，與記憶力減退和認(rèn)知障礙有關(guān)。目前，AD尚無明確的治愈方法，目前可用的治療干預(yù)措施無法逆轉(zhuǎn)甚至阻止AD的進(jìn)展過程。

• 與帕金森病類似，hAEC對AD動物模型也有良好的治療作用。據(jù)報道，通過立體定向注射或靜脈注射將hAEC移植到AD小鼠模型（Tg轉(zhuǎn)基因小鼠）的側(cè)腦室，可顯著改善其行為表現(xiàn)，同時減輕空間記憶缺陷，促進(jìn)前腦海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元生長，并增加乙酰膽堿的產(chǎn)生。
• 此外，hAEC移植可減少Aβ沉積形成的斑塊并降低β-分泌酶 (BACE) 活性，而BACE活性對于調(diào)節(jié)Aβ40和Aβ42的產(chǎn)生至關(guān)重要。

這些研究表明hAECs將成為治療AD的有希望的候選藥物。

人羊膜上皮細(xì)胞治療免疫疾病

hAEC具有免疫調(diào)節(jié)特性。因此，hAEC有望在免疫疾病的臨床應(yīng)用中擴(kuò)大其治療潛力。在我們之前的研究中，將hAEC移植到通過在NCG小鼠中注射人PBMC建立的急性GVHD小鼠模型中，顯著減少了炎癥細(xì)胞向靶器官和器官病變的浸潤，提高了小鼠的存活率，延長了它們的壽命。

基于這些動物研究，2022年，中國國家藥品監(jiān)督管理局 (NMPA) 藥品審評中心 (CDE) 批準(zhǔn)了hAEC用于aGVHD治療的首個新藥研究 (IND) 申請，并于2023年11月啟動了I期臨床試驗。這項I期臨床研究的結(jié)果將加強(qiáng)hAEC在治療其他免疫疾病方面的應(yīng)用潛力。

大量研究表明，hAECs和hAECs條件培養(yǎng)基 (hAECs-CM) 具有多種免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性。它們分泌多種抗炎因子，如MIF、TGF-β、IL-10和PGE2，因此，hAECs可以有效抑制T細(xì)胞增殖和活化，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

hAEC已用于治療多種免疫介導(dǎo)的炎癥疾病，如自身免疫性葡萄膜炎、橋本甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病和多發(fā)性硬化癥 (MS)。

人羊膜上皮細(xì)胞治療組織損傷與修復(fù)

hAEC的生物學(xué)功能包括保護(hù)胎兒免受機(jī)械損傷，分泌激素和因子，支持胚胎發(fā)育，因此hAEC也可能有利于組織修復(fù)。關(guān)于hAEC在組織修復(fù)中的應(yīng)用研究很多，包括子宮、卵巢、腎臟、角膜、肝臟和肺臟的損傷。

關(guān)于hAEC作為組織修復(fù)生物干預(yù)的臨床研究也在宮腔粘連（NCT03381807）、Asherman綜合征（NCT03223454）、原發(fā)性卵巢功能不全/卵巢早衰/不孕癥（NCT02912104、NCT03207412）、支氣管瘺（NCT02959333）、痙攣性腦癱（NCT03107975）和不愈合骨折（NCT03031509）等領(lǐng)域進(jìn)行。

在一項關(guān)于持續(xù)性角膜上皮缺損 (PED) 的臨床研究中，發(fā)現(xiàn)hAEC與膠原蛋白護(hù)盾結(jié)合使用可促進(jìn)PED消退。1例患者接受兩輪hAEC接種膠原蛋白護(hù)盾治療后，PED完全消退；2例患者接受四輪hAEC接種膠原蛋白護(hù)盾治療后，PED完全消退；所有患者接受治療后7至12周內(nèi)出現(xiàn)視力下降，且所有患者均保持臨床改善，平均隨訪時間為6.3個月。

除了上述情況的應(yīng)用外，hAEC還表現(xiàn)出對心肌梗塞、腦出血、視網(wǎng)膜變性、肺泡缺損、肺損傷、慢性肝功能衰竭、腺體損傷、內(nèi)耳損傷等的治療潛力。所有這些都需要未來的臨床研究，然后才能轉(zhuǎn)化為治療產(chǎn)品來幫助患者。

08結(jié)論和未來挑戰(zhàn)

盡管近年來干細(xì)胞療法在治療各種疾病方面取得了進(jìn)展，包括ESC、iPSC和MSC，但關(guān)于它們的效力、穩(wěn)定性、致癌性、免疫反應(yīng)、細(xì)胞來源和倫理道德方面仍存在許多不清楚的問題和未解決的問題。人們對其治療潛力的主要擔(dān)憂是致瘤性高風(fēng)險和侵入性。

hAEC來源于人羊膜，作為醫(yī)療廢物，羊膜易于獲取且倫理爭議較少，并且不具有致瘤性和低免疫原性潛力。人們已經(jīng)研究了hAEC在各種疾病中的應(yīng)用，并探索了相關(guān)的潛在機(jī)制，使其成為治療疾病的更好的替代細(xì)胞來源。

參考資料：Yang J, Lu Y, Zhao J, Luo Y, Hao W, Zhang W and He Z (2024) Reinvesting the cellular properties of human amniotic epithelial cells and their therapeutic innovations. Front. Immunol. 15:1466529. doi: 10.3389/fimmu.2024.1466529

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