背景：大腦作為人類功能活動(dòng)的“總部”，損傷后的再生和修復(fù)是當(dāng)今科學(xué)界面臨的難題。腦神經(jīng)元具有難以再生的遺傳特性以及創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后的抑制性微環(huán)境是神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵困難。

因此，TBI后功能恢復(fù)的重點(diǎn)是促進(jìn)損傷后的神經(jīng)再生，創(chuàng)造合適的微環(huán)境。越來(lái)越多的證據(jù)證明，使用干細(xì)胞來(lái)源的外泌體比直接移植干細(xì)胞可以在治療TBI方面帶來(lái)更多益處，為神經(jīng)再生創(chuàng)造新的治療途徑。

自1987年Johnstone首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體并將其命名為“外泌體”以來(lái)，目前用于腦再生的無(wú)細(xì)胞治療策略已經(jīng)得到發(fā)展。該領(lǐng)域取得了顯著的進(jìn)展，特別是在TBI再生修復(fù)中的應(yīng)用。我們對(duì)外泌體生物學(xué)效應(yīng)理解的進(jìn)展對(duì)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，它們可以廣泛用作腦修復(fù)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的有效介質(zhì)。研究證實(shí)，外泌體對(duì)于大腦內(nèi)外的細(xì)胞間通訊至關(guān)重要，表明外泌體不僅在細(xì)胞內(nèi)短距離傳輸信號(hào)，而且還通過(guò)腦脊液廣泛傳播到整個(gè)大腦。

近日，國(guó)際《Stem Cell Research&Therapy》期刊發(fā)表了一項(xiàng)《神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體成為創(chuàng)傷性腦損傷的無(wú)細(xì)胞治療策略》的綜述，該綜述首先描述了神經(jīng)干細(xì)胞外泌體的基本特征和生物學(xué)效應(yīng)。其次，總結(jié)了神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體在TBI診斷和治療中的作用及其可能機(jī)制。最后，討論了神經(jīng)干細(xì)胞外泌體治療創(chuàng)傷性腦損傷所面臨的挑戰(zhàn)。

神經(jīng)干細(xì)胞與外泌體概述

外泌體是細(xì)胞分泌的小囊泡，攜帶生物信息，并通過(guò)內(nèi)體和質(zhì)膜途徑產(chǎn)生。外泌體不僅可以作為疾病診斷和治療的生物標(biāo)志物，而且可以作為細(xì)胞間通訊的主要媒介。此外，外泌體在膜細(xì)胞向細(xì)胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)和核糖核酸（RNA）的運(yùn)輸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。外泌體的生物發(fā)生包括其內(nèi)容物以及隨后的途徑和機(jī)制。

神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以替代因損傷而受損或耗盡的神經(jīng)細(xì)胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞可以作為一種天然的活躍活性資源，并被認(rèn)為是治療TBI的潛在工具。大量研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植可以顯著再生受損組織。NSC分泌的外泌體被認(rèn)為可以增加基于干細(xì)胞的治療的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兡軌蚩朔淠阁w神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的風(fēng)險(xiǎn)和困難。

有人提出神經(jīng)干細(xì)胞外泌體可以自由穿透血腦屏障（BBB）、抑制細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥和調(diào)節(jié)自噬。神經(jīng)干細(xì)胞外泌體作為無(wú)干細(xì)胞治療策略，可以滿足修復(fù)和再生治療的需求，成為TBI治療的非常有前景的候選者。

外泌體含量及鑒定

外泌體富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能、影響細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。人們普遍認(rèn)為，外泌體成分可能因其來(lái)源和細(xì)胞類型而異。外泌體已被鑒定含有4563個(gè)蛋白質(zhì)、764個(gè)miRNA、1639個(gè)mRNA和194個(gè)脂質(zhì)。

值得注意的是，人類神經(jīng)干細(xì)胞（hNSCs）除了表達(dá)外泌體的常見(jiàn)標(biāo)記蛋白CD63和CD81外，還表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白c-MYC蛋白。第二代測(cè)序顯示，hNSC外泌體所含的miRNA與其他來(lái)源的miRNA不同。hNSCs分泌的miRNA有113種，其中高表達(dá)的miRNA有5種，包括hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4508、hsa-miR-4492和hsa-miR-4516。作為高表達(dá)的miRNA之一，miR-1246是一種p53靶向miRNA，在調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和凋亡方面發(fā)揮著重要作用。另一項(xiàng)研究表明，miR-21a在NSCs分泌的外泌體中高表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和再生（圖1）。

神經(jīng)干細(xì)胞外泌體可能通過(guò)作用于周圍細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用。例如，神經(jīng)干細(xì)胞衍生的外泌體，尤其是miR-9，通過(guò)抑制Hes1促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，外泌體分泌的miR-150-3p通過(guò)靶向CASP2來(lái)防止神經(jīng)元凋亡，或者高水平的miR-21a可以促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元，從而導(dǎo)致膠質(zhì)疤痕減少

外泌體的發(fā)生途徑和機(jī)制

外泌體作為細(xì)胞內(nèi)的主要通訊媒介，可以通過(guò)不同途徑與靶細(xì)胞結(jié)合以傳遞信息。目前普遍認(rèn)為外泌體的生物合成主要涉及質(zhì)膜途徑和內(nèi)體途徑。在內(nèi)體途徑中，早期內(nèi)體從質(zhì)膜出芽形成早期內(nèi)體；隨后，早期內(nèi)體萌發(fā)腔內(nèi)囊泡（ILV）形成多囊泡體（MVB），最后，MVB與質(zhì)膜融合釋放外泌體。此外，一些證據(jù)已經(jīng)證實(shí)外泌體可以直接從質(zhì)膜出芽，即質(zhì)膜途徑。

目前，研究最多的外泌體生物發(fā)生途徑是內(nèi)體途徑。細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷可形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體（Rab5為標(biāo)志物）通過(guò)酸化和物質(zhì)交換成熟為晚期內(nèi)體（Rab7為標(biāo)志物）。晚期內(nèi)體最終可以形成含有ILV的MVB，ILV由多泡膜向內(nèi)萌芽的凹陷構(gòu)成。多囊泡通過(guò)與溶酶體或自噬溶酶體融合而被降解，與細(xì)胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致管腔囊泡分泌到細(xì)胞外，最終形成直徑范圍為40至160nm的外泌體（圖2）。

外泌體的純化和儲(chǔ)存

由于外泌體體積小、密度低且成分相似，外泌體的分離對(duì)其分離提出了巨大的挑戰(zhàn)。NSCs和其他細(xì)胞分泌的外泌體的常見(jiàn)分離方法主要包括超速離心、超濾和尺寸排阻層析、聚合物沉淀、免疫親和捕獲層析和微流控芯片分離。在這些方法中，超速離心是最常用的方法，目前被視為外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，不同的分離技術(shù)也會(huì)影響外泌體的生物活性。因此，標(biāo)準(zhǔn)化的分離流程和定量方法對(duì)于外泌體質(zhì)量和臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

對(duì)于外泌體的保存條件來(lái)說(shuō)，能夠在體外保持外泌體的完整性也是極其重要的。一些研究表明，不同的儲(chǔ)存條件可能會(huì)影響外泌體的大小，但對(duì)外泌體攜帶的貨物沒(méi)有太大影響。數(shù)據(jù)顯示，在37°C下儲(chǔ)存兩天后，外泌體大小減少了約60%。4℃保存兩天后外泌體大小基本保持不變，而3~4天后外泌體大小明顯下降。有趣的是，外泌體的形態(tài)和大小在?20°C下保存可以保持一個(gè)月。迄今為止，仍缺乏證據(jù)表明外泌體可以在體外穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，因此在體外維持外泌體完整性的挑戰(zhàn)仍然嚴(yán)峻。

神經(jīng)干細(xì)胞外泌體的生物學(xué)效應(yīng)

神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的多種相互作用。此外，神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體可將活性物質(zhì)從神經(jīng)元轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能、突觸活動(dòng)、神經(jīng)血管完整性和髓鞘化。一方面，NSCs分泌的外泌體可將特定顆粒從原始細(xì)胞攜帶到靶細(xì)胞，導(dǎo)致病理變化加劇，如阿爾茨海默?。ˋD）中的淀粉樣β蛋白（Aβ）和tau蛋白β、海綿狀腦病中的朊病毒蛋白和帕金森?。≒D）中的α-突觸核蛋白。另一方面，神經(jīng)干細(xì)胞外泌體可作為神經(jīng)保護(hù)因子，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生和神經(jīng)損傷修復(fù)。

神經(jīng)干細(xì)胞外泌體治療創(chuàng)傷性腦損傷的機(jī)制

先前的一項(xiàng)研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞有望成為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床實(shí)踐中TBI治療的有效策略。然而，最近已經(jīng)證明，神經(jīng)干細(xì)胞與創(chuàng)傷性腦損傷后腦重塑和功能恢復(fù)相關(guān)的主要機(jī)制并不依賴于細(xì)胞替代效用，而是可能依賴于旁分泌效應(yīng)，例如神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體。

近期研究證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞外泌體作為信號(hào)分子的載體，參與介導(dǎo)腦損傷后病理過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞的通訊，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞間的信息通訊參與TBI后損傷的發(fā)生和修復(fù)。細(xì)胞。小RNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及精選miRNA和蛋白質(zhì)的驗(yàn)證證明，人iPSC衍生的NSC的外泌體富含參與促神經(jīng)再生、抗凋亡、抗炎癥、抗氧化作用、血腦屏障修復(fù)的miRNA和蛋白質(zhì)此外，它們還含有促進(jìn)突觸可塑性和增強(qiáng)認(rèn)知功能恢復(fù)的miRNA和/或蛋白質(zhì)（圖3）。

• NSCs分泌的外泌體含有多種細(xì)胞活性成分，可以自由穿過(guò)血腦屏障、抑制炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生和血管生成等。
• 針對(duì)神經(jīng)再生，NSCs分泌含有circAcbd6的外泌體，進(jìn)一步促進(jìn)NSCs的分化通過(guò)miR-320-5p/氧甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白2軸進(jìn)入膽堿能神經(jīng)元。
• NSC衍生的外泌體含有抑制炎癥反應(yīng)、下調(diào)TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子表達(dá)并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1向M2表型極化的成分。
• 抗凋亡后，NSC分泌的外泌體轉(zhuǎn)移miR-150-3p（一種富集的miRNA），并抑制神經(jīng)元凋亡。NSC外泌體引起的自噬標(biāo)記蛋白LC3B和beclin-1表達(dá)增加也減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。為了促進(jìn)血管生成，神經(jīng)干細(xì)胞外泌體可以上調(diào)VEGF水平，從而加速血管生成。

工程神經(jīng)干細(xì)胞外泌體針對(duì)腦損傷的潛在治療作用

由于其獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)、缺乏免疫原性、低毒性、良好的滲透性，具有穿越血腦屏障的能力，加之它們?cè)诮M織再生、免疫等方面的重要作用，調(diào)控和疾病識(shí)別，外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療中具有巨大的治療潛力，但天然外泌體的靶向能力較差，從而大大降低了治療效果。

工程化外泌體具有主動(dòng)靶向特定細(xì)胞類型和組織的能力。納米技術(shù)的發(fā)展為靶向藥物遞送帶來(lái)了新的希望，基于外泌體結(jié)構(gòu)和功能的納米制劑有望克服中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，將神經(jīng)保護(hù)分子轉(zhuǎn)移至腦實(shí)質(zhì)，為針對(duì)腦區(qū)域的治療提供有效的治療手段中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病。

制備工程外泌體的策略之一是細(xì)胞工程。親代細(xì)胞的基因工程是常用的細(xì)胞工程技術(shù)之一，即在外泌體生物發(fā)生過(guò)程中直接修飾外泌體。

外泌體工程學(xué)是即在適當(dāng)條件下利用特定技術(shù)對(duì)純化的外泌體表面蛋白或內(nèi)容物進(jìn)行修飾，主要分為孵育法、物理法、皂化法和表面修飾法。與細(xì)胞工程的低效率和高難度相比，直接修飾純化的天然外泌體可以直接獲得大量工程外泌體，減少細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的不確定性，對(duì)工程外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義（圖4）。

前景和挑戰(zhàn)

與大多數(shù)外泌體類似，神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體在腦損傷的治療中具有以下優(yōu)勢(shì)。

• 首先，外泌體是納米大小的囊泡，可以順利穿過(guò)血腦屏障并且易于吸收，靜脈注射后小血管閉塞的可能性非常低。
• 其次，外泌體負(fù)責(zé)細(xì)胞間的傳遞，當(dāng)腦損傷發(fā)生時(shí)，內(nèi)源性NSCs釋放外泌體，向其他細(xì)胞傳達(dá)需要救援的信息，實(shí)現(xiàn)受損大腦的修復(fù)和再生。
• 第三，NSCs分泌的外泌體具有低免疫原性，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一種無(wú)細(xì)胞療法，且沒(méi)有明顯的副作用。
• 第四，與干細(xì)胞培養(yǎng)和保存的難度相比，植入后生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法控制，并且由于懷疑形成腫瘤，干細(xì)胞外泌體可以在制劑中儲(chǔ)存并注射到血液中，很容易被利用吸收。

鑒于此，研究神經(jīng)干細(xì)胞外泌體為優(yōu)化基于細(xì)胞的療法提供了見(jiàn)解，并有助于理解腦損傷后基于外泌體療法的再生和修復(fù)的確切機(jī)制。

神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體在再生治療領(lǐng)域顯示出前景，包括TBI的治療。盡管TBI治療中神經(jīng)干細(xì)胞衍生的外泌體研究的數(shù)量不斷增加且取得了有希望的結(jié)果，但臨床前和臨床研究的轉(zhuǎn)化研究仍有很長(zhǎng)的路要走。

目前，尚缺乏安全、有效、高產(chǎn)的外泌體生產(chǎn)和純化方法，限制了外泌體用于疾病治療的臨床轉(zhuǎn)化。因此，應(yīng)深入探討神經(jīng)干細(xì)胞外泌體的純化和保存方法標(biāo)準(zhǔn)，以確保獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的外泌體，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞外泌體用于TBI治療的臨床轉(zhuǎn)化。

盡管目前NSC外泌體的臨床轉(zhuǎn)化面臨挑戰(zhàn)，但除了基因修飾外，神經(jīng)干細(xì)胞外泌體還可以與載藥納米粒子結(jié)合，發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，賦予神經(jīng)干細(xì)胞外泌體未來(lái)更廣闊的發(fā)展前景。

結(jié)論

總之，目前最有希望的腦損傷治療方法之一是基于神經(jīng)干細(xì)胞外泌體給藥。由于大腦神經(jīng)損傷后神經(jīng)干細(xì)胞外泌體具有有益作用，因此有必要探索神經(jīng)干細(xì)胞外泌體調(diào)節(jié)神經(jīng)再生的潛在機(jī)制。

神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體治療腦損傷的潛在機(jī)制可能是由于其神經(jīng)再生、抗炎、血管生成和抗凋亡特性（圖3）。此外，考慮到神經(jīng)干細(xì)胞的工程化外泌體可能會(huì)在不同水平上影響腦功能，不同治療途徑（靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或原位）的TBI療效也有所不同。因此，根據(jù)TBI患者的需求定制神經(jīng)干細(xì)胞外泌體治療策略對(duì)于增強(qiáng)基于外泌體的無(wú)細(xì)胞療法的效果至關(guān)重要。

參考資料：Zhong, L., Wang, J., Wang, P. et al. Neural stem cell-derived exosomes and regeneration: cell-free therapeutic strategies for traumatic brain injury. Stem Cell Res Ther 14, 198 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03409-1

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