干細(xì)胞治療

干細(xì)胞，包括胚胎干（ES）細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干（iPS）細(xì)胞和成體干細(xì)胞，具有自我更新和產(chǎn)生分化細(xì)胞的能力。它們分化成不同組織細(xì)胞的潛力使其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用特別有趣——例如，ES細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞移植有望用于心肌再生。然而，自1957年開(kāi)發(fā)出第一種使用干細(xì)胞的療法以來(lái)，只有少數(shù)基于干細(xì)胞的療法進(jìn)入臨床。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的數(shù)據(jù)，已有數(shù)千項(xiàng)干細(xì)胞治療相關(guān)臨床試驗(yàn)注冊(cè)。

目前，唯一獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的干細(xì)胞療法是造血祖細(xì)胞（HPC）移植用于患有影響造血系統(tǒng)疾病的患者的造血和免疫重建。此外，一些源自間充質(zhì)干細(xì)胞或組織特異性干細(xì)胞的干細(xì)胞產(chǎn)品已被批準(zhǔn)用于臨床，例如在加拿大批準(zhǔn)用于治療急性移植物抗宿主病的Prochymal，以及在美國(guó)批準(zhǔn)用于治療急性移植物抗宿主病的Holoclar。歐洲修復(fù)受傷角膜^[1]。缺乏臨床轉(zhuǎn)化可能是由于干細(xì)胞治療存在一些不可避免的缺點(diǎn)。干細(xì)胞直徑較大，靜脈注射后可能會(huì)在肺部積聚，從而產(chǎn)生輸注毒性。此外，同種異體干細(xì)胞攜帶可能引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原。此外，干細(xì)胞注射可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤并發(fā)癥，包括血液和非血液惡性腫瘤（分別為畸胎瘤和非畸胎瘤）^[2]。觀察到的干細(xì)胞的一些有益作用可能部分歸因于它們的旁分泌作用，而不是移植干細(xì)胞的長(zhǎng)期植入^[3]。

干細(xì)胞來(lái)源的外泌體

干細(xì)胞就像人體中的所有其他細(xì)胞一樣，釋放外泌體以相互交流。外泌體是直徑約40-160nm的膜結(jié)合囊泡，通過(guò)內(nèi)體途徑從細(xì)胞中釋放。外泌體以核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物形式存在的多種成分，不僅反映了它們的細(xì)胞起源，而且賦予它們潛在的治療功能，類似于它們的供體細(xì)胞，可用于無(wú)細(xì)胞療法^[4]。因此，干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的治療應(yīng)用已被臨床前探索。

至少有150項(xiàng)臨床試驗(yàn)已在ClinicalTrials.gov上注冊(cè)，研究基于外泌體的療法治療多種疾病，包括呼吸道疾病、傳染病和癌癥（在 www.clinicaltrials.gov上使用“外泌體療法”作為關(guān)鍵詞搜索）。在這些試驗(yàn)中，31項(xiàng)應(yīng)用源自干細(xì)胞（主要是來(lái)自不同組織的間充質(zhì)干細(xì)胞）的外泌體，并作為間充質(zhì)干細(xì)胞療法的替代方案進(jìn)行測(cè)試。這些臨床前和臨床研究表明，干細(xì)胞釋放的外泌體可能部分重現(xiàn)其供體細(xì)胞的治療效果，而沒(méi)有干細(xì)胞治療固有的缺點(diǎn)（表1）。

與干細(xì)胞相反，外泌體不能自我復(fù)制，消除了對(duì)干細(xì)胞移植后潛在腫瘤形成的擔(dān)憂。外泌體也足夠穩(wěn)定，適合長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存和凍干后室溫儲(chǔ)存。它們的小尺寸進(jìn)一步允許通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行滅菌^[5]。此外，外泌體可以通過(guò)多種途徑施用；例如，霧化或凍干的肺干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)吸入給藥來(lái)治療肺部疾病^[5,6]。此外，它們的親水腔和含有膜蛋白的磷脂雙層可以被工程化和修飾以展示分子或用于藥物裝載；最近，肺干細(xì)胞衍生的外泌體被重組SARS-CoV-2的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾，作為可吸入的COVID-19疫苗^[7]。

2020年，Codiak Biosciences啟動(dòng)了首個(gè)工程化外泌體療法（exoSTING^[8]）的臨床試驗(yàn)（ NCT04592484?），用于治療多種實(shí)體瘤，表明工程化外泌體可能是干細(xì)胞源性外泌體治療應(yīng)用的未來(lái)方向。

干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的臨床轉(zhuǎn)化

干細(xì)胞和外泌體治療的市場(chǎng)前景廣闊。據(jù)全球市場(chǎng)報(bào)告顯示，預(yù)計(jì)到2030年全球干細(xì)胞市場(chǎng)將達(dá)到316億美元，全球外泌體市場(chǎng)預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到10.3億美元。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院于2017年發(fā)布了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院人類干細(xì)胞研究指南。

2009年，主要包括有關(guān)人類ES和iPS細(xì)胞的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)和倫理問(wèn)題。此外，一些國(guó)際協(xié)會(huì)，包括國(guó)際干細(xì)胞研究學(xué)會(huì)和國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)，提出了解決干細(xì)胞和外泌體研究中存在分歧問(wèn)題的指南^[9,10]。這些指南為干細(xì)胞和外泌體研究提供資源；然而，全球?qū)ζ渑R床轉(zhuǎn)化和制造的共識(shí)仍然難以實(shí)現(xiàn)。值得注意的是，F(xiàn)DA必須發(fā)布幾項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞和外泌體產(chǎn)品的公共安全通知。因此，需要針對(duì)干細(xì)胞和外泌體治療制定全面的標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)。令人鼓舞的是，第一個(gè)干細(xì)胞相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 24603）于2022年8月發(fā)布，外泌體研究也可參考該標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)化外泌體治療的外泌體生產(chǎn)上游步驟。

干細(xì)胞和外泌體療法的臨床轉(zhuǎn)化依賴于在良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）設(shè)施中大規(guī)模生產(chǎn)干細(xì)胞和外泌體。HPC移植的發(fā)展嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞治療產(chǎn)品GMP設(shè)施的建立。然而，用于外泌體生成、分離和質(zhì)量控制的GMP設(shè)施仍然有限。用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離外泌體的基于燒瓶的培養(yǎng)系統(tǒng)和超速離心方法緩慢、費(fèi)力，并且與GMP級(jí)外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)不兼容?；蛘?，正在探索生物反應(yīng)器系統(tǒng)和中空纖維膜分別用于細(xì)胞培養(yǎng)和過(guò)濾，以大規(guī)模生產(chǎn)外泌體。

此外，需要進(jìn)行徹底的質(zhì)量控制，以最大限度地減少外泌體的批次間差異。因此，需要能夠準(zhǔn)確且可重復(fù)地表征外泌體的方法，包括濃度、粒徑、Zeta電位和外泌體標(biāo)記。ZetaView、Amnis、ImageStream 和 ONI Nanoimager 等儀器能夠表征外泌體的理化性質(zhì)，并可能取代納米顆粒跟蹤分析、動(dòng)態(tài)光散射、蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)方法。外泌體質(zhì)量控制還應(yīng)考慮外泌體的異質(zhì)性，其受到供體細(xì)胞狀態(tài)和分離方法的影響。

因此，需要標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，這可以基于腺相關(guān)病毒的制造，類似于外泌體的生產(chǎn)和純化。應(yīng)建立一個(gè)精簡(jiǎn)的封閉操作系統(tǒng)，將外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)與可歸檔的質(zhì)量控制測(cè)試計(jì)劃結(jié)合起來(lái)。

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