前言：由于成年哺乳動物大腦的自我修復(fù)和再生能力有限，以不可逆的細(xì)胞損傷為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)，通常被認(rèn)為是難治性疾病。神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）因其自我更新和形成不同神經(jīng)譜系細(xì)胞（如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）的能力，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。隨著對神經(jīng)發(fā)育認(rèn)識的不斷深入和干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步，可以從不同來源獲得神經(jīng)干細(xì)胞，并定向分化為特定的神經(jīng)譜系細(xì)胞表型，使得替代某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中丟失的特定細(xì)胞成為可能，這提供了新的途徑。

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近日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科聯(lián)合武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室對神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病和缺血性中風(fēng)進(jìn)行了新研究，研究結(jié)果發(fā)表在《自然》子刊cell death discovery上，文章證實(shí)了

• 不同來源的神經(jīng)干細(xì)胞可以在體外被誘導(dǎo)分化為成熟且有功能的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
• 移植預(yù)分化神經(jīng)干細(xì)胞可以分化成熟為特定類型的細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病或中風(fēng)模型的恢復(fù)。
• 目前，來自人類胚胎干細(xì)胞的多巴胺能神經(jīng)元經(jīng)過神經(jīng)干細(xì)胞階段，正在帕金森病患者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測試。

在這篇文章中，我們概述了從不同來源的神經(jīng)干細(xì)胞生成幾種神經(jīng)元譜系亞型的進(jìn)展。我們進(jìn)一步總結(jié)了這些特定的神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的治療效果和可能的治療機(jī)制，特別是帕金森病和缺血性中風(fēng)。最后，我們從臨床轉(zhuǎn)化的角度，比較了不同來源的NSCs和不同定向分化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了NSCs定向分化在再生醫(yī)學(xué)中的未來研究方向。

開放式問題

• 對于神經(jīng)退行性疾病或中風(fēng)，哪種神經(jīng)干細(xì)胞來源和哪種定向分化方法將使移植細(xì)胞符合良好生產(chǎn)規(guī)范指南？

• 移植神經(jīng)干細(xì)胞分化的最佳時間窗是多少？
• 移植的預(yù)分化神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞替代的潛在機(jī)制是什么？

什么是神經(jīng)退行性疾??？

神經(jīng)退行性疾病 (ND) 是一組異質(zhì)性疾病，其特征是神經(jīng)元進(jìn)行性和選擇性喪失，導(dǎo)致感覺喪失、運(yùn)動和記憶障礙，以帕金森病 (PD)、亨廷頓舞蹈病 (HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和多發(fā)性硬化癥（MS）為代表。缺血性中風(fēng)是最常見的中風(fēng)類型，由于流向大腦部分的血流減少，導(dǎo)致缺血核心的神經(jīng)元和非神經(jīng)元死亡。如果有足夠的時間，缺血半暗帶中組織功能的可逆性喪失可能是永久性的。這些疾病直接威脅患者的生命，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，目前針對這些疾病的治療方法并不具有治愈性且相對有限，大多數(shù)只能緩解癥狀并延緩病程。

神經(jīng)修復(fù)與再生治療是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想方法。這方面已經(jīng)做了大量的工作，主要是從內(nèi)源性和外源性兩個方面來促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和再生。神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC) 是一類多能細(xì)胞，其定義是基于其強(qiáng)大的自我更新能力和分化成各種中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型的能力。NSC介導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生已在多種病理狀況中得到證實(shí)，例如癲癇、多發(fā)性硬化癥、缺血性中風(fēng)和AD，但僅靠內(nèi)源修復(fù)是不夠的。

神經(jīng)干細(xì)胞移植策略作為再生醫(yī)學(xué)的一種，在NDs的治療中受到越來越多的關(guān)注。此外，隨著干細(xì)胞領(lǐng)域的進(jìn)步，用于移植的NSCs來源已從最初的直接分離腦組織擴(kuò)展到多能干細(xì)胞（PSCs）的分化和體細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。迄今為止，基于NSC的療法已在許多ND和缺血性中風(fēng)的嚙齒動物模型中實(shí)施，并且一些研究提出了解釋NSC改善疾病作用的潛在機(jī)制，包括神經(jīng)炎癥抑制、神經(jīng)元替代、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)營養(yǎng)支持，從而促進(jìn)ND和中風(fēng)模型的恢復(fù)。

然而，直接移植的神經(jīng)干細(xì)胞不可忽視的挑戰(zhàn)是低存活率和不合理的分化。在ND和缺血性中風(fēng)中，可以觀察到CNS中先天免疫細(xì)胞的慢性或急性激活。神經(jīng)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的宿主微環(huán)境可能在移植的神經(jīng)干細(xì)胞的存活和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，參與炎癥途徑的自噬已被證明可以調(diào)節(jié)移植的NSC的分化。

為了克服直接移植NSCs的局限性，并考慮到某些ND中特定細(xì)胞類型丟失的病理特征，人們致力于探索移植前操縱NSCs命運(yùn)以控制終末譜系以替代NSCs的可行性。目前，通過使用化學(xué)定義系統(tǒng)或關(guān)鍵譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子的異位過度表達(dá)，不同來源的神經(jīng)干細(xì)胞可以在體外定向分化為特定類型的神經(jīng)譜系細(xì)胞，如DAergic神經(jīng)元、GABAergic神經(jīng)元、膽堿能運(yùn)動神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、谷氨酸能神經(jīng)元。隨后的研究進(jìn)行了預(yù)分化細(xì)胞的體內(nèi)移植，以研究其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療作用（圖1）。

不同來源神經(jīng)干細(xì)胞體外定向分化

目前，NSCs可通過三種不同方式獲得：直接從原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中提取、PSCs分化和體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（圖2）。

NSCs存在于整個發(fā)育中的大腦。在成年哺乳動物腦中，NSCs可見于海馬顆粒下區(qū)、室管膜下區(qū)，甚至整個腦室系統(tǒng)的多個部位。包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)在內(nèi)的PSCs可通過兩種主要方法在體外誘導(dǎo)分化為NSCs：類胚體(EB)形成和粘附單層培養(yǎng)。

具體來說，PSCs的神經(jīng)分化過程是多步驟的，首先通過去除促進(jìn)自我更新的介質(zhì)，引發(fā)向胚胎三個胚層的分化，隨后通過在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，抑制胚外和中胚層分化，促進(jìn)神經(jīng)分化。此外，同時抑制轉(zhuǎn)化生長因子β和BMP信號通路的雙重SMAD抑制可減少培養(yǎng)變異性，提高神經(jīng)誘導(dǎo)的效率。

此外，PSCs的神經(jīng)誘導(dǎo)還可以通過與基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的共培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，這可以為限制PSCs向神經(jīng)系的命運(yùn)提供線索。誘導(dǎo)的NSCs可以直接從體細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞（PBMNCs）、成纖維細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞重新編程。不同來源的NSCs可被誘導(dǎo)分化為所需的神經(jīng)系細(xì)胞。

目前，NSCs可通過三種途徑獲得：1）從原代中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中分離，主要包括成人和胎兒的腦組織；2）通過EB形成或單層培養(yǎng)從多能干細(xì)胞（iPSC和ESC）分化，雙重SMAD抑制可以促進(jìn)神經(jīng)誘導(dǎo)過程；3）由體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，如血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)、EB胚狀體、ESC胚胎干細(xì)胞、IPSC誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

了解神經(jīng)系統(tǒng)的自然發(fā)育對于操縱NSC的定向分化至關(guān)重要。到目前為止，已開發(fā)出兩種主要的誘導(dǎo)分化方法：化學(xué)限定系統(tǒng)和內(nèi)在轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的方法，通過它可以產(chǎn)生所需的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型，例如DAergic神經(jīng)元、MSN、膽堿能運(yùn)動神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)谷氨酰胺能神經(jīng)元（圖3）。

神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化在神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的治療潛力

目前涉及的主要神經(jīng)疾病模型包括PD、HD、MS、ALS和缺血性中風(fēng)。在這里，我們主要概述了NSCs衍生的特定表型在慢性神經(jīng)退行性疾病PD和急性神經(jīng)退行性缺血性中風(fēng)中的治療潛力。

帕金森病

帕金森病（PD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，病理特征是黑質(zhì)緊密層的DA能神經(jīng)元變性，隨后支配紋狀體的DA能軸突末梢丟失，導(dǎo)致運(yùn)動障礙。目前，PD的主要治療方法是多巴胺替代療法。然而，它只能緩解PD的癥狀而不能延緩PD的進(jìn)展。關(guān)于體外靶向分化VM DAergic神經(jīng)元的成功，一些研究已將這些細(xì)胞移植到不同的PD模型中，以觀察它們在行為、細(xì)胞和分子水平上的治療效果。

上述大多數(shù)研究將預(yù)分化的NSC植入6-OHDA或MPTP誘導(dǎo)的PD模型的紋狀體中，導(dǎo)致感覺運(yùn)動改善，例如自發(fā)活動增加和轉(zhuǎn)圈行為減少?？紤]到放置在黑質(zhì)中的VM組織移植物無法將軸突延伸足夠長以到達(dá)其目標(biāo)區(qū)域紋狀體以形成復(fù)雜的神經(jīng)回路，因此考慮異位植入。植入后，其中一些經(jīng)過預(yù)處理的NSC可以在PD動物模型中存活，并表現(xiàn)出黑質(zhì)DAergic神經(jīng)元的表型，多巴胺水平增加。

延申閱讀：拜耳表示神經(jīng)元干細(xì)胞療法治療帕金森?。菏讉€1期臨床試驗(yàn)取得積極結(jié)果

因此，目前的研究表明，異位和同位移植的VMDA神經(jīng)元都可以進(jìn)行突觸前和突觸后整合，并且很自然地假設(shè)重建的功能性黑質(zhì)-紋狀體回路導(dǎo)致PD模型中的運(yùn)動恢復(fù)。

除了移植位置，DA能神經(jīng)元分化的最佳移植時間窗對黑質(zhì)-紋狀體回路的重建也很重要。以VM組織為供體，移植時供體細(xì)胞的成熟度顯著影響移植物的組成和功能結(jié)果。具體來說，在DA神經(jīng)發(fā)生高峰期（胚胎第12天）之前分離的供體組織在移植物中產(chǎn)生更多的DA能神經(jīng)元，這歸因于植入時DA神經(jīng)母細(xì)胞存活和增殖增加。

缺血性中風(fēng)

缺血性卒中是一種腦血管事件，雖然不屬于神經(jīng)退行性疾病，但在梗死區(qū)也會 出現(xiàn)病理性細(xì)胞死亡，包括不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。近年來，缺血性卒中的有限治療包括血管內(nèi)手術(shù)（稱為血栓切除）或靜脈注射阿替普酶（稱為溶栓）以恢復(fù)血流。然而，由于治療窗狹窄、一些禁忌癥、溶栓再通大動脈的療效低，甚至再通后存在 再灌注損傷，只有一小部分缺血性患者能從這兩種治療中獲益?？赡苁鞘躈Ds丟失的特定細(xì)胞替代療法的啟發(fā)，最近有研究針對缺血性卒中丟失的不同細(xì)胞類型移植特定細(xì)胞進(jìn)行替代，以重建受損的神經(jīng)回路。

一項(xiàng)臨床和影像學(xué)研究顯示，卒中患者癥狀最嚴(yán)重時受損細(xì)胞的分布往往不在紋狀體，提示細(xì)胞替代策略應(yīng)強(qiáng)調(diào)重建受損皮層而非紋狀體。因此，一些研究將來源于PSCs的具有皮質(zhì)谷氨酸能表型的祖細(xì)胞植入缺血性卒中大鼠模型的皮質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以緩解移植后2個月或6個月的感覺運(yùn)動障礙。移植后2個月的早期行為改善很可能不是神經(jīng)元替代和電路整合的結(jié)果。

延申閱讀：神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦缺血性中風(fēng)的回顧與展望

徐等人提出了一個兩步方案，從iPSC中穩(wěn)定快速地衍生NG2陽性O(shè)PC，首先抑制SHH生成NPC，然后過表達(dá)Olig2。將OPCs移植到缺血大鼠的腦室后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以通過抑制炎癥和免疫反應(yīng)來保護(hù)宿主神經(jīng)元在缺血環(huán)境下免于死亡。此外，這些細(xì)胞通過促進(jìn)缺血性中風(fēng)大鼠的髓鞘再生過程，在一定程度上挽救了學(xué)習(xí)和記憶喪失。

討論和未來方向

根據(jù)對細(xì)胞移植的大量研究，可以推斷，移植前的歷史和供體細(xì)胞的來源都是影響移植結(jié)果的關(guān)鍵因素。

還需要考慮用于產(chǎn)生特定神經(jīng)元譜系表型的原代中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和細(xì)胞類型的選擇，因?yàn)樗赡軙绊懮窠?jīng)元譜系分化的效率和移植的有效性。原代中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織來源的NSC的潛力因獲得它們的發(fā)育階段和分離地點(diǎn)而異。例如，在相同的培養(yǎng)條件下，來自腹側(cè)中腦的 NSC比來自紋狀體的NSC產(chǎn)生更多的DAergic神經(jīng)元，并且在神經(jīng)發(fā)育過程中A9神經(jīng)元比A10神經(jīng)元更早產(chǎn)生，因此早期VM衍生的NSC更有利于A9DAergic神經(jīng)元的生成。

與組織源性NSC或ESC相比，iPSC和iNSC不受倫理問題的影響。此外，與PSC移植物相比，源自人iNSC的神經(jīng)移植物在移植后不太可能產(chǎn)生快速生長的腫瘤。目前，正在積極采取多種策略來解決各種來源的移植細(xì)胞潛在病理性生長的可能性，例如在移植前使用細(xì)胞分選技術(shù)去除脫靶污染細(xì)胞類型或轉(zhuǎn)導(dǎo)配體激活的自殺基因以消除體內(nèi)增殖細(xì)胞。近年來隨著誘導(dǎo)神經(jīng)元（iN）技術(shù)的快速發(fā)展，直接對體細(xì)胞進(jìn)行重編程獲得功能性神經(jīng)元成為可能。然而，iN方法將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為非分裂神經(jīng)元，而不是命運(yùn)定型的神經(jīng)元祖細(xì)胞，并且這些非分裂神經(jīng)元在移植后往往在宿主大腦中存活和整合不良。

此外，供體細(xì)胞移植前應(yīng)充分考慮不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特殊病理狀態(tài)，這可能在一定程度上影響細(xì)胞移植策略。在神經(jīng)退行性疾病中，細(xì)胞替代的結(jié)果取決于需要恢復(fù)的連接模式的復(fù)雜性和精確性。在帕金森病的病例中，只有部分模式修復(fù)才能導(dǎo)致顯著的功能恢復(fù)。DA能細(xì)胞的異位移植，也被稱為旁分泌策略，可以恢復(fù)多巴胺的有效釋放，從而調(diào)節(jié)黑質(zhì)紋狀體回路。目前，基于納米技術(shù)、分子生物學(xué)和成像技術(shù)的進(jìn)步，移植細(xì)胞追蹤技術(shù)已經(jīng)從體外檢測轉(zhuǎn)向體內(nèi)成像，進(jìn)一步結(jié)合病毒或基因標(biāo)記策略，可以幫助研究者探索移植細(xì)胞與宿主腦之間的突觸聯(lián)系。

除了移植定向誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞外，體內(nèi)細(xì)胞重編程、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原位轉(zhuǎn)化為功能性新神經(jīng)元也是一種有前景的神經(jīng)再生策略。此外，移植的外源干細(xì)胞可通過基因工程穩(wěn)定地產(chǎn)生生長因子，支持修復(fù)功能障礙的內(nèi)源性神經(jīng)元。例如，人iPSC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞經(jīng)基因工程改造后可穩(wěn)定產(chǎn)生GDNF，移植后可釋放GDNF，保護(hù)PD模型和ALS模型中的變性神經(jīng)元。因此，研究人員以不同的方式投入了大量精力，以實(shí)現(xiàn)相同的目標(biāo)：促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)或再生。

最近的臨床前研究已經(jīng)證明了源自PSCs的DA能神經(jīng)元的安全性和有效性。基于這些充滿希望的結(jié)果，各國正在開展臨床試驗(yàn)。PD臨床試驗(yàn)為其他衍生神經(jīng)系細(xì)胞進(jìn)入這些未知領(lǐng)域提供了重要的指導(dǎo)，我們相信在不久的將來，從不同來源的NSCs，特別是PSCs衍生的神經(jīng)系細(xì)胞將在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測試，以開發(fā)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法。

參考資料：Nie, L., Yao, D., Chen, S. et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9, 215 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01532-9

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