間充質(zhì)干細(xì)胞移植是一種治療慢性肝病的新興療法。臨床前和臨床研究已經(jīng)評估了這種療法的潛力。盡管間充質(zhì)干細(xì)胞移植的機制仍未完全明了，但不斷積累的證據(jù)顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、分化和抗纖維化特性在肝臟再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多臨床研究已觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞對慢性肝病患者的安全性和治療效果。然而，由于目前移植細(xì)胞的可行性有限，治療效果僅略有改善。

在此，我們討論了幾種旨在提高細(xì)胞移植活力的策略，以及未來使用基于細(xì)胞外囊泡的療法治療肝病的潛在挑戰(zhàn)。

介紹

慢性肝損傷，例如由病毒感染、酗酒或代謝性疾病引起的肝損傷，會導(dǎo)致肝硬化和衰竭。終末期肝硬化的最終治療方法是肝移植。然而，在許多國家，移植并不容易獲得，而在可以進行移植的國家，器官短缺和與移植相關(guān)的高昂費用使得這對許多患者來說是不切實際的選擇。

干細(xì)胞移植已被提議作為肝病患者預(yù)防進展和治療晚期纖維化患者的潛在策略。干細(xì)胞移植，包括造血干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)，可被操縱分裂成肝細(xì)胞樣細(xì)胞體外和體內(nèi)。在這些細(xì)胞類型中，MSC已被證明具有相對容易獲得和具有低免疫原性的優(yōu)點。它們具有自我更新能力，可以分化成各種譜系的細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞在倫理方面是安全的，因為它們并非源自體細(xì)胞。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞移植被認(rèn)為是安全的，并在各種疾病的臨床環(huán)境中進行了廣泛評估，并取得了有希望的結(jié)果。

本綜述的目的是介紹間充質(zhì)干細(xì)胞在肝臟疾病中的治療效果，以解決有關(guān)有效性、安全性和可能涉及的風(fēng)險的問題，并討論基于間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床治療的最新臨床進展，為進一步治療肝病開辟新的道路。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植概述

間充質(zhì)干細(xì)胞移植的定義和來源

間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為中胚層或外胚層細(xì)胞，從而產(chǎn)生貼壁的多能成纖維細(xì)胞型干細(xì)胞。不同的研究人員以不同的方式定義MSC特征。為了解決這個問題，國際細(xì)胞治療學(xué)會推薦了一組三個標(biāo)準(zhǔn)來定義人類間充質(zhì)干細(xì)胞：粘附性、特異性表面抗原表達和多能分化潛能（表1）。

MSC可以從大多數(shù)器官或組織中分離出來，包括骨髓（BM）、臍帶血（UCB）、脂肪組織（AT）、外周血、骨小梁、滑膜、軟骨和肌肉。其中，三個主要來源已被證明能夠治療肝病：BM-MSC、UCB-MSC和 AT-MSC。一般來說，眾所周知，這三種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達相似的表面抗原，但它們的形態(tài)和增殖率各不相同。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病的治療機制

1) 轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞

源自間充質(zhì)干細(xì)胞的肝細(xì)胞樣細(xì)胞被認(rèn)為是肝臟再生的替代來源。MSC的肝分化受到多種因素的影響。首先，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過多種細(xì)胞因子和生長因子處理，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）、成纖維細(xì)胞生長因子-2/4、表皮生長因子、制瘤素M、白血病抑制因子、地塞米松、胰島素等，分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。此外，與肝細(xì)胞和沉淀培養(yǎng)物共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)MSC分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。然而，在臨床前環(huán)境中，MSC轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞的比例不到肝臟總質(zhì)量的1%。應(yīng)開發(fā)更有效的肝細(xì)胞分化技術(shù)，利用肝細(xì)胞分化的MSC治療肝臟疾病。

2）免疫調(diào)節(jié)

炎癥引起的慢性肝損傷伴隨著T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤（圖1）。

據(jù)報道，免疫抑制劑有利于肝移植前后的肝再生。在這方面，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性可以對肝臟疾病產(chǎn)生有利的影響。首先，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過釋放各種可溶性因子來下調(diào)T細(xì)胞，例如一氧化氮、前列腺素E（PGE）-2、吲哚胺2,3-雙加氧酶、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10和人白細(xì)胞抗原G。這些因子可以控制各種免疫細(xì)胞的增殖和功能，并上調(diào)Treg細(xì)胞。MSC 還可以通過直接與 T 淋巴細(xì)胞相互作用來抑制T細(xì)胞的增殖。

MSCs的免疫抑制能力是由干擾素-γ、IL-1a和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子的組合產(chǎn)生的。這些細(xì)胞因子幫助一些趨化因子和免疫細(xì)胞與MSC保持接觸并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。此外，MSC可以抑制B細(xì)胞的活化，降低免疫球蛋白的水平。最后，MSC已被證明可以誘導(dǎo)炎癥巨噬細(xì)胞向替代巨噬細(xì)胞極化。這種改變釋放出可改善肝損傷的可溶性因子（即IL-10和IL-1Ra）。

3) 抗纖維化活性

慢性肝損傷導(dǎo)致靜止的肝星狀細(xì)胞 (HSC) 轉(zhuǎn)分化為纖維化肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生過量的ECM蛋白并導(dǎo)致纖維化。MSC治療可通過間接或直接細(xì)胞間接觸來減弱活化HSC的增殖和膠原蛋白沉積。在間接接觸機制中，MSC分泌的幾種可溶性因子（即TNF-β3、TNF-α、IL-10和HGF）會減弱膠原合成，而HGF和神經(jīng)生長因子則誘導(dǎo)HSC凋亡。接下來，與HSC共培養(yǎng)的MSC通過細(xì)胞間接觸抑制HSC的增殖和α-平滑肌肌動蛋白 (SMA) 的表達。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和MMP組織抑制劑（TIMP）有助于肝纖維化的進展和消退。在一些纖維化模型中，MSC調(diào)節(jié)MMP（即MMP-2、-9、-13和-14）和TIMP-1的表達。增加MMPs的表達并減少TIMPs的表達。

我們準(zhǔn)備好在常規(guī)臨床實踐中進行間充質(zhì)干細(xì)胞移植了嗎？

間充質(zhì)干細(xì)胞移植的有效性和安全性現(xiàn)狀

多項臨床試驗已經(jīng)闡明了間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性肝病的優(yōu)勢（表2）。

Study (year)	Liver disease	Patients, sample size (MSC/control)	Cell source	Graft type	Injection route	Cell doses	Duration of follow-up (mo)	Primary outcomes
Mohamadnejad et al. (2007)	Decompensated LC	4/0	BM	Auto	PV	31.7×106	12	MELD score, liver function test, and liver volumes
Kharaziha et al. (2009)	LC (MELD ≥10)	8/0	BM	Auto	Portal vein (n=6)	3.0–5.0×107	6	MELD score, liver function test, and serum creatinine
or PV (n=2)
Amer et al. (2011)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	1) IS (n=10)	2.0×107	6	MELD score, Child-Pugh score, ascites, edema, liver function test, and fatigue
2) IH (n=10)
Peng et al. (2011)	Chronic HBV-associated liver failure	158/0	BM	Auto	HA	1.0×106	12	MELD score, liver function test, and self-reported symptoms
El-Ansary et al. (2012)	Chronic HCV-associated LC	15/10	BM	Auto	PV	1.0×106	12	MELD score and serum albumin level
Shi et al. (2012)	Chronic HBV-associated liver failure	24/19	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, liver function test, and survival rates
Zhang et al. (2012)	Chronic HBV-associated decompensated LC	30/15	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	MELD score, ascites, and liver function test
Amin et al. (2013)	Chronic HCV-associated LC	20/0	BM	Auto	IS	1.0×107	6	MELD score and liver function test
Mohamadnejad et al. (2013)	Decompensated LC	15/12	BM	Auto	PV	1.0×106	12	No improvement
Wang et al. (2013)	UDCA-resistant PBC	7/0	UCB	Allo	PV	0.5×106	12	Serum alkaline phosphatase and γ-GT levels
Jang et al. (2014)	Alcohol-related LC	11/0	BM	Auto	HA	5.0×107	4	MELD score and liver histology
Salama et al. (2014)	Chronic HCV-associated LC	20/20	BM	Auto	PV	1.0×106	6	MELD score and Child-Pugh score
Wang et al. (2014)	UDCA-resistant PBC	10/0	BM	Allo	PV	3.0–5.0×105	12	Serum levels of ALT, AST, γ-GT, and IgM
Xu et al. (2014)	Chronic HBV-associated LC	27/29	BM	Auto	HA	8.45×105	6	MELD score improvement and reduction in IL-6, IL-17, TNF-α levels
Suk et al. (2016)	Alcohol-associated LC	37/18	BM	Auto	HA	5.0×107	12	Child-Pugh score and Histologic fibrosis
Lanthier et al. (2017)	Decompensated alcoholic hepatitis	28/30	BM	Auto	HA	4.7×107	1	No improvement
Lin et al. (2017)	Chronic HBV-associated liver failure	56/54	BM	Allo	PV	1.0×106	6	MELD score and survival rates
Detry et al. (2017)	Liver transplant recipients	10/9	BM	Allo	PV	1.5–3.0×106	12	No difference of rate of infection or de novo cancer

Mohamadnejad進行的一項試點研究等人。2007年的第35次研究表明，輸注自體間充質(zhì)干細(xì)胞治療四名失代償性肝硬化患者是安全可行的。6個月時，四分之三的患者的終末期肝病模型 (MELD) 評分有所改善，其中兩人在12個月內(nèi)保持穩(wěn)定。

Amer進行的一項2期研究中等人。2011年發(fā)表的第37篇文章中，40名丙型肝炎相關(guān)肝硬化患者被隨機分為兩組，每組20名患者：第一組接受自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，第二組接受最佳支持治療。與第二組相比，第一組的Child-Pugh和MELD評分顯著改善，并維持了6個月。

施等人報道，24名乙型肝炎相關(guān)慢性肝衰竭患者接受靜脈UCB-MSC輸注治療，19名患者接受生理鹽水治療作為對照。UCB-MSC輸注顯著提高了72周的存活率，并且直到隨訪結(jié)束才觀察到明顯的副作用。

阿明也得到了類似的結(jié)果等人研究表明，脾內(nèi)自體移植改善了20名丙型肝炎相關(guān)性肝硬化患者的肝功能，具體表現(xiàn)為總膽紅素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平和凝血酶原時間顯著降低，凝血酶原時間顯著增加。

Jang發(fā)表的開放標(biāo)簽試驗等人。2014年的45項研究表明，通過肝動脈進行自體BM-MSC移植治療酒精濫用相關(guān)的肝硬化具有有益效果。54.5%的患者觀察到組織學(xué)改善；第二次注射后12周，Child-Pugh評分從7.1提高到5.4，纖維化相關(guān)標(biāo)志物包括TNF-β1、1型膠原和α-SMA的水平顯著下降。

最近，一項隨機2期試驗報道，對72名酒精相關(guān)性肝硬化患者進行肝動脈注射自體BM-MSC可以減輕肝纖維化并改善Child-Pugh評分。

最近的一項臨床研究還報告了肝移植受者接受間充質(zhì)干細(xì)胞治療的可行性、安全性和耐受性（n=10）。間充質(zhì)干細(xì)胞治療已被認(rèn)為對缺血/再灌注損傷具有潛在的有益作用。這項研究為利用間充質(zhì)干細(xì)胞作為未來潛在的治療方法為需要終生免疫抑制的肝移植受者開辟了道路。

然而，兩項臨床研究獲得了陰性結(jié)果。穆罕默德內(nèi)賈德等人報告稱，與對照組（n=12）相比，通過外周靜脈注射的自體BM-MSC移植（n=15）可能沒有任何有益效果。在12個月的隨訪中，MSC 治療組和對照組之間 Child-Pugh 評分、MELD 評分、血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝臟體積的絕對變化沒有差異。

另一項研究報道，28名酒精性肝炎患者接受了自體BM衍生的CD34⁺治療干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞以及30名患者僅接受支持療法。4周隨訪時肝活檢中增殖性肝細(xì)胞數(shù)量兩組間無顯著差異。然而，與接受標(biāo)準(zhǔn)治療的患者相比，接受干細(xì)胞治療的患者表現(xiàn)出更活躍的肝臟巨噬細(xì)胞擴張。

大多數(shù)研究表明干細(xì)胞療法對于肝病患者是安全有效的。然而，許多此類臨床研究的試驗設(shè)計的規(guī)模和性質(zhì)意味著無法得出有意義的結(jié)論，因此其療效尚未得到證實。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植途徑

關(guān)于移植的間充質(zhì)干細(xì)胞的植入存在相互矛盾的數(shù)據(jù)，并且對其纖維化潛力提出了一些擔(dān)憂。這些不良影響似乎取決于間充質(zhì)干細(xì)胞輸注的途徑和劑量。盡管據(jù)報道效果因注射途徑而略有不同，但間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過靜脈注射、肝內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、脾內(nèi)注射或門靜脈注射移植到肝臟中。外周靜脈被認(rèn)為是最常見的移植途徑，其次是肝動脈、脾內(nèi)注射、肝內(nèi)注射和門靜脈。通過外周靜脈施用的BM-MSC已被證明在慢性損傷的情況下可以很好地遷移到肝實質(zhì)中體內(nèi)。

相比之下，在急性損傷環(huán)境中觀察到有限的MSC植入。此外，當(dāng)通過肝內(nèi)動脈注射時，間充質(zhì)干細(xì)胞在肝組織中持續(xù)存在，這表明間充質(zhì)干細(xì)胞是存在的，并且不會分化為肝細(xì)胞。此外，在臨床試驗中，門靜脈輸注比外周途徑更有效。然而，直接方法，例如通過門靜脈或肝動脈，可能會帶來細(xì)胞注射后門靜脈高壓出血的風(fēng)險。總體而言，到目前為止，大多數(shù)臨床研究提供的證據(jù)還相當(dāng)缺乏。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植的潛在風(fēng)險

迄今為止，關(guān)于MSC治療慢性肝病的臨床和臨床前研究已經(jīng)開展，但必須謹(jǐn)慎考慮幾個問題，包括致癌和病毒傳播的可能性。間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌多種生長因子，促進腫瘤細(xì)胞生長和血管生成。先前的實驗研究表明，惡性形成的傾向取決于傳代次數(shù)。例如，在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中，傳代超過3次后就觀察到染色體異常和轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，例如肉瘤。此外，MSC可能在多次傳代后表現(xiàn)出端粒缺失。盡管臨床試驗中尚未觀察到人類間充質(zhì)干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，但由于隨訪時間太短，大多數(shù)人間充質(zhì)干細(xì)胞的腫瘤發(fā)生并不明顯。因此，在MSCs移植前必須分析染色體完整性，以確保手術(shù)的安全性。

與自體移植相反，同種異體移植可能存在病毒傳播給患者的風(fēng)險。盡管已證明細(xì)小病毒B19可以病毒傳播至 BM細(xì)胞體外, B19陽性MSC相關(guān)病毒血癥尚未在人類中報道。然而，目前尚無關(guān)于單純皰疹病毒（HSV）和巨細(xì)胞病毒（CMV）通過間充質(zhì)干細(xì)胞傳播的信息體內(nèi)。因此，由于免疫抑制患者存在感染的可能性，MSC受體和供體可能都需要進行細(xì)小病毒B19、HSV和CMV篩查。

肝病間充質(zhì)干細(xì)胞移植的未來方向

臨床研究表明僅具有中等益處，至少部分是因為無論細(xì)胞來源如何，移植細(xì)胞的活力有限。甚至有報道稱，由于移植時遇到的微環(huán)境缺乏靈活性，移植細(xì)胞的存活率不到1%。在本節(jié)中，我們將回顧用于提高 MSC移植中細(xì)胞治療效果的策略（圖2）。

1. 組織工程

組織工程方法的目的是讓細(xì)胞在開始再生之前在移植器官中歸巢和適應(yīng)，從而提高細(xì)胞存活率。ECM在細(xì)胞組織和功能中起著至關(guān)重要的作用。已經(jīng)研究了多種方法，包括共培養(yǎng)和3維 (3D) 系統(tǒng)的開發(fā)。在3D系統(tǒng)中生長的細(xì)胞可能表現(xiàn)得更像細(xì)胞體內(nèi)并直接植入。這些3D系統(tǒng)可分為基于支架的系統(tǒng)和無支架系統(tǒng)。

幾種合成聚合物，包括聚乳酸共乙醇酸 (PLGA) 和天然材料，如膠原蛋白，已被評估其在肝分化過程中增加 MSC中肝細(xì)胞特異性基因表達的能力。事實上，在PLGA支架上共培養(yǎng)BM來源的MSC和分離的新鮮肝細(xì)胞時，顯示了肝功能的調(diào)節(jié)。使用MSC與肝細(xì)胞比例為1:5時觀察到的性能效果最大體外和體內(nèi)。除了基于支架的3D系統(tǒng)外，多個小組還評估了生物支架（例如脫細(xì)胞組織）的作用。脫細(xì)胞肝組織形成ECM支架，可以通過提供更生理的環(huán)境來改善MSC植入。

2. 預(yù)處理提高細(xì)胞抵抗力

在治療過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞被移植到病理疾病條件下。換句話說，病理條件使植入的細(xì)胞面臨嚴(yán)重的酸性、氧化和營養(yǎng)應(yīng)激。在這方面，移植前修飾供體細(xì)胞有助于這些細(xì)胞抵抗惡劣條件，從而改善細(xì)胞功能。幾種預(yù)處理策略包括通過將細(xì)胞暴露于物理或環(huán)境沖擊以及目標(biāo)分子的藥理學(xué)調(diào)節(jié)劑來促進廣泛的促生存反應(yīng)。

3. 基因工程

已經(jīng)研究了幾種方法來促進參與供體細(xì)胞歸巢的蛋白質(zhì)的表達。MSC已被證明表達低水平的分子，包括歸巢因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1和趨化因子受體（即CXCR4和CCR1受體）。對促存活或抗凋亡基因（包括 Bcl-2、蛋白激酶 B (Akt/PBK)、HGF 和存活蛋白）進行基因操作可提高 MSC 存活率體內(nèi)。眾所周知，miRNA可以調(diào)節(jié)mRNA，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)，包括那些參與細(xì)胞存活的基因網(wǎng)絡(luò)。miRNA過度表達已被證明可以提高MSC的存活率。然而，在應(yīng)用基因操作時必須仔細(xì)考慮幾個問題，包括致癌風(fēng)險。

4. 細(xì)胞外囊泡作為無細(xì)胞療法

間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌具有旁分泌作用的可溶性分子或釋放更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，稱為細(xì)胞外囊泡（EV）。EV通過與細(xì)胞表面相互作用、內(nèi)化或與細(xì)胞膜融合來發(fā)揮許多作用。這些EV可以被設(shè)計來改善預(yù)期活性的表達或引入特定的效應(yīng)分子。

結(jié)論

間充質(zhì)干細(xì)胞再生療法通過其免疫調(diào)節(jié)、分化和抗纖維化特性對慢性肝病有效。許多臨床研究已證明間充質(zhì)干細(xì)胞可通過改善組織纖維化和改善肝功能來治療受損的肝細(xì)胞。然而，仍然存在一些問題，包括遷移率低、細(xì)胞存活率低以及致癌和病毒傳播的風(fēng)險。我們回顧了幾種增強其功效的策略，包括改變培養(yǎng)環(huán)境和/或啟動 MSC以及細(xì)胞基因工程。此外，MSC產(chǎn)生的EV似乎通過保留細(xì)胞的至少一些免疫調(diào)節(jié)特性，作為基于MSC的移植中的無細(xì)胞細(xì)胞療法具有治療益處。

基于間充質(zhì)干細(xì)胞的慢性肝病細(xì)胞療法的前景將取決于細(xì)胞來源、培養(yǎng)條件、給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)化以及未來大規(guī)模臨床試驗的結(jié)果。

主要參考文獻：

Kang SH, Kim MY, Eom YW, Baik SK.  Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Liver Disease: Present and Perspectives.  Gut and Liver 2020;14:306-315.  https://doi.org/10.5009/gnl18412

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