肝病在世界范圍內普遍存在。當它到達末期時，死亡率上升到50%或更多。盡管肝移植已成為終末期肝病最有效的治療方法，但其應用受到供體肝臟稀缺的限制。缺乏可接受的供體器官意味著患者在等待合適的肝臟時處于高風險之中。在這種情況下，細胞療法已成為一種很有前途的治療方法。

大多數(shù)情況，移植細胞可以替代宿主肝細胞并重塑肝臟微環(huán)境。例如，來自供體肝臟的肝細胞或干細胞在肝臟中定植和增殖，可以替代宿主肝細胞，恢復肝功能。其他候選細胞療法，如巨噬細胞和間充質干細胞，可以重塑肝臟微環(huán)境，從而修復受損的肝臟。

近年來，細胞療法已從動物研究轉向早期人體研究。近日，浙江中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院等在《Stem Cell Research&Therapy》國際期刊中發(fā)表了一篇《終末期肝病的細胞治療：替代與重塑》的文獻綜述。

在這篇綜述中，我們將討論終末期肝病治療中的干細胞療法，尤其關注用于細胞移植的各種細胞類型，并闡明所涉及的過程。此外，我們還將總結細胞療法的實際障礙并提供潛在的解決方案。

細胞療法的多種細胞來源和治療部位

肝小葉基本呈六邊形，門脈三聯(lián)體（門靜脈、膽管和肝動脈）位于小葉的外圍，中央靜脈位于中間。肝細胞作為肝臟的原代實質細胞，承擔著肝臟的大部分生理功能，并由于肝臟強大的再生能力而維持一定的肝體比。因此，可以將肝細胞植入肝臟以促進肝臟再生，這意味著移植的肝細胞會增殖并取代宿主肝細胞（圖1)。

然而，肝細胞的獲取和保存是一個普遍的問題。為了獲得更多的肝細胞，一些團隊逐漸開始使用干細胞或具有干細胞特性的可轉分化或分化為肝細胞的細胞進行細胞移植（圖1）。例如，膽管上皮細胞(BEC) 可以轉分化為肝細胞，我們認為這是由于細胞可塑性。標記BEC表明，在嚴重肝損傷的情況下，這些細胞可以轉化為肝細胞，暗示它們可能是可移植細胞的來源。

在最近的研究中，源自膽管細胞的肝外類器官已被證明可以在移植后保持人膽管樹內的可塑性，并且可以修復人肝內膽管。在進一步的研究中，多能干細胞（PSCs）和胎肝祖細胞可能在體外分化為肝細胞或肝細胞樣細胞用于細胞治療，這將在后面詳細描述（圖1）。

細胞移植前，膽管上皮細胞、多能干細胞和胎肝祖細胞必須在體外分化為肝細胞。移植后，這些細胞在肝臟內增殖并取代宿主肝細胞。此外，間充質干細胞、巨噬細胞和造血祖細胞可以重塑肝臟微環(huán)境。肝臟、脾臟和腹膜都是細胞移植的潛在部位

除了替換宿主肝細胞和在肝臟內擴張外，移植細胞還可以重塑肝臟微環(huán)境（圖1）。例如，移植細胞可以對終末期肝病發(fā)揮免疫調節(jié)、抗炎和抗纖維化作用。

此外，已經(jīng)表明，骨髓移植細胞在放棄轉分化時，可能會刺激肝細胞增殖并恢復肝功能。總之，移植細胞可以通過更換宿主肝細胞和重塑肝臟微環(huán)境來治療肝臟疾?。▓D1)。

更換受損的肝臟

肝細胞

已顯示成體肝細胞在體內擴張，類似于造血干細胞。根據(jù)新英格蘭醫(yī)學雜志的病例報告，一名患有I型Crigler-Najjar綜合征和嚴重未結合高膽紅素血癥的10歲女孩通過門靜脈輸注7.5×109個肝細胞得到有效治療，并且對患者的治療益處持續(xù)長達11個月，并允許過渡到原位肝移植（OLT）。此外，肝細胞移植 (HT) 已被用于治療患有肝臟代謝異常的兒科患者，并且正在進行多項調查以提高細胞的可用性和安全性。

另一方面，肝細胞懸液可以安全地進入門靜脈，證明細胞療法比OLT 具有更低的手術風險。斯特羅姆等人。已顯示肝細胞脾動脈輸注對慢性終末期肝病患者的安全性和治療效果。

急性肝衰竭 (ALF) 是一種罕見的急性疾病，死亡率很高。細胞療法更適合具有典型肝臟結構的ALF患者。在幾個研究中心，已經(jīng)進行了臨床肝細胞移植研究。

來自印度的7名患者接受了來自26-34周大未出生嬰兒的胎兒肝細胞腹膜輸注。結果顯示，HT患者的總生存率比對照組高10%。比里爾等描述了五名接受脾內HT治療的ALF患者。移植后48小時，5名患者中的3名在HT后的腦病評分、血氨水平、凝血酶原時間和總生存率方面均有顯著改善。

總的來說，肝細胞移植的應用顯示出對終末期肝病的巨大治療潛力。然而，這種方法有局限性。主要挑戰(zhàn)之一是肝細胞的可用性和植入效率有限，以及制造困難。這些障礙包括難以從供體肝臟中分離出高質量細胞、在維持活力的同時冷凍保存肝細胞的機制限制、移植肝細胞的植入和增殖水平低，以及與細胞輸送相關的問題。

胎肝祖細胞

在體外，胎肝祖細胞（FLPs）可以分化成肝細胞（圖1）。已經(jīng)表明，來自人類和其他靈長類動物的胎兒肝細胞可能在免疫缺陷小鼠的肝臟中增殖和成熟，重新填充10%的器官。此外，已經(jīng)表明FLP可以分化為功能性人內皮細胞，并且在移植后九個月內未觀察到腫瘤發(fā)展。

多能干細胞

多能干細胞 (PSC) 在細胞移植前需要分化為肝細胞，被認為是HT的替代細胞來源（圖1）。為了區(qū)分胚胎干細胞 (ESC) 和誘導多能干細胞 (iPSC ) ，已開發(fā)出多種技術。ESC來源于受精后4-5天在人類囊胚細胞簇中形成的多能干細胞。由于對ESC的研究由來已久，一些方案利用細胞發(fā)育信號來促進ESC向肝細胞樣細胞 (HLC) 的分化。此外，ESC移植后的免疫排斥和ESC獲取的倫理問題也是不可避免的問題。2013年，許多研究小組使用核移植從患者的體細胞中有效地創(chuàng)建了ESC，盡管該過程在技術上仍具有挑戰(zhàn)性。

類器官

類器官的應用越來越引起研究人員的興趣?！邦惼鞴佟北欢x為從干細胞或成體細胞生長的三維 (3D) 結構。與二維（2D）細胞系相比，類器官具有器官結構和遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)勢。合適的類器官被認為是可用細胞療法的重要來源。之前的研究已經(jīng)成功地從Lgr5+細胞和iPSCs 構建了肝臟類器官，可用于治療小鼠肝功能衰竭。

武部等據(jù)報道，移植后，肝臟類器官可以重建功能性血管，使小鼠免受藥物性肝損傷 。福布斯等。使用由純化的人膽管上皮細胞 (hBEC) 構建的類器官，在膽道疾病小鼠模型中挽救了膽管結構和功能。劍橋大學的一項研究發(fā)現(xiàn)，膽管細胞類器官在人體肝臟移植后可以修復膽管損傷。

總之，類器官在細胞移植中顯示出巨大的前景。未來的研究可以應用肝臟/膽管細胞類器官治療終末期肝病，并提高擴大的肝臟供體庫中擴大標準供體的質量。

重塑肝臟微環(huán)境

抗炎和免疫調節(jié)作用：除了替換宿主肝細胞外，移植細胞還通過重塑肝臟微環(huán)境來促進LR。重要因素之一是移植細胞的免疫調節(jié)作用。間充質干細胞 (MSC) 因其分離、生長和保存簡單而常用于臨床。MSC最初是在骨髓中分離出來的，也可以從臍帶和脂肪組織中獲得（圖2）。

MSCs能夠通過分泌抗炎因子來抑制免疫細胞的增殖和促炎細胞因子的分泌。MSCs通過分泌前列腺素E2 (PGE2)、受激基因/蛋白6和吲哚胺2,3-雙加氧酶 (IDO) 來改善巨噬細胞的抗炎作用。促炎細胞因子，如IL-1β和IL-6，也被MSCs抑制。此外，MSCs以IDO依賴性方式抑制抗體的產(chǎn)生和分泌以及活化B淋巴細胞的增殖?？傊?，可以利用MSCs的抗炎和免疫調節(jié)作用來促進肝臟再生。

從骨髓、臍帶和脂肪組織中獲得的MSCs可以通過促進巨噬細胞的極化子從M1到M2并抑制HSCs來減少ECM沉積。

抗纖維化：纖維化是終末期肝病的主要表現(xiàn)之一。MSCs和巨噬細胞能有效緩解肝纖維化和ECM沉積。MSC的主要功能是在LR期間釋放多種營養(yǎng)因子以抑制肝星狀細胞 (HSC) 活化和ECM形成，從而通過T細胞、B細胞和巨噬細胞的免疫調節(jié)減少纖維化、細胞凋亡和炎癥（圖2）。

Lin等人的另一項工作。表明MSCs可能會阻止激活的HSCs的增殖并促進它們的死亡。某些臨床試驗已經(jīng)證實了間充質干細胞移植對慢性肝病患者的治療益處。

根據(jù)Lin等人的一項隨機對照試驗，外周輸注同種異體骨髓間充質干細胞對于HBV相關ACLF患者是安全實用的。通過增強肝功能和降低嚴重感染的風險，這種治療顯著增加了24周生存期。此外，已經(jīng)表明，通過肝動脈輸注施用的MSC可顯著降低患者的肝纖維化，并導致Child–Pugh評分顯著改善。然而，相對于一次移植，肝纖維化在兩次MSC移植后并未惡化。由于這些原因，間充質干細胞被認為是細胞治療的潛在細胞來源。

肝臟巨噬細胞是慢性肝損傷病理生理學中的關鍵細胞之一，最近被強調為可能的抗纖維化靶點。巨噬細胞在組織損傷后會發(fā)生顯著的表型和功能變化，并且對于組織恢復的啟動、維持和解決階段至關重要。

最近，研究了肝硬化患者對自體巨噬細胞輸注治療的反應。福布斯等對9名肝硬化患者進行自體巨噬細胞治療，MELD評分為10至16 (ISRCTN 10,368,050)。一年之內，所有人都還活著并且沒有進行移植，達到了研究的安全性和可行性的主要目標。這項工作為肝硬化和其他纖維化疾病的細胞治療提供了理論基礎。

總之，間充質干細胞和巨噬細胞對肝臟的再生至關重要，可作為細胞療法的來源。

組織修復和再生

細胞療法的另一個功能是促進組織修復和再生。造血祖細胞在這個過程中起主要作用。

目前的假設認為，造血祖細胞治療受損肝臟后的治療改善主要是通過供體和宿主細胞之間的旁分泌信號刺激內源性祖細胞介導的，后者提供細胞因子和生長因子。

在最近的臨床研究中，接受造血祖細胞移植的酒精性肝硬化患者取得了持久的治療效果。E.Yannaki等人證明G-CSF在急性肝損傷模型中加速恢復并提高存活率。在一項大型隨機對照臨床研究中，G-CSF與通過門靜脈輸注自體造血祖細胞的組合顯著提高了存活率和肝功能（通過Child–Pugh評分和肝臟生物化學測量）。然而，接受G-CSF或輸注G-CSF和自體CD133+細胞的肝硬化患者沒有明顯的效果。這些臨床研究的多樣性可能源于不同的輸液方案、輸液技術和劑量。

優(yōu)化細胞療法的操作

細胞輸送

肝臟高度血管化；因此，移植細胞可以通過幾種不同的途徑給藥，其中門靜脈或肝動脈是最常見的（圖3）。移植的細胞應被輸送到肝竇，在那里它們隨后需要與肝實質整合。最常見的臨床技術是通過門靜脈進行細胞輸注。成人有三種選擇：肝內脾靜脈支流穿刺、肝內門靜脈支流穿刺和經(jīng)頸靜脈通過肝靜脈系統(tǒng)的肝內門靜脈分流術。

對于新生兒，通過臍靜脈插管進入。對于年齡較大的兒童，可以使用腹腔鏡或最小解剖手術或切開法將中央靜脈插管置入門靜脈支架中。

根據(jù)細胞的大小，肝細胞穿過竇狀靜脈，暫時阻塞門靜脈周圍血管區(qū)域，隨后通過血管通透性恢復正常血流。然而，所有這些治療方案都有出血的風險，特別是對于經(jīng)常有門脈高壓、側支循環(huán)形成和凝血功能障礙的肝病患者。

因此，有兩種可能的解決方案來管理這個問題：

(1) 連續(xù)多普勒超聲監(jiān)測以確保門靜脈壓力不超過12mmHg和

(2)移植細胞的肝動脈給藥(圖3)。

與門靜脈方法相反，肝動脈通常用作內部放射治療和動脈化療栓塞的導管，并且可以作為一種更有效的細胞輸送方式。其他研究提出了替代策略，例如肝硬化患者的脾內細胞輸注和ALF患者的腹膜遞送方法 。這些策略的優(yōu)點是它們允許功能性肝臟恢復，同時防止肝臟免疫排斥。

圖3：肝細胞移植的優(yōu)化。通過肝動脈或脾臟進行的肝細胞移植可能會導致更好的定植。

并且肝細胞到達肝臟后可能被巨噬細胞排斥。巨噬細胞吞噬供體肝細胞并分泌TGF-β以誘導衰老。在這種情況下，巨噬細胞可以通過將供體肝細胞包裹在水凝膠中來避免吞噬作用。另一方面，可以通過照射肝臟或注射血管上皮生長因子來增強供體肝細胞的增殖優(yōu)勢

細胞恢復和增殖

移植后供體細胞的活性和增殖能力對細胞治療的有效性起著重要作用。肝細胞保存一直是一個嚴重的問題。冷凍保存顯著損害肝細胞，減少ATP生成并下調整合素-β1和E-鈣粘蛋白。同時，使用細胞凋亡抑制劑和胱硫醚抑制劑改善了肝細胞的活性和功能。

結論和觀點

隨著全球肝移植需求的增長，需要更多的研究來彌合供體肝臟和等待名單患者之間的差距，并改善肝移植受者的長期預后。在過去的幾十年里，細胞療法取得了顯著進步，證明了干細胞治療肝病的有效性和安全性。在將其用于臨床試驗之前，必須解決許多挑戰(zhàn)，包括從供體肝臟中分離出高質量的細胞，增強細胞植入以減少免疫反應，以及改善植入和長期結果。

此外，干細胞或具有干細胞特性的細胞可用于解決與肝細胞獲取相關的挑戰(zhàn)。源自iPSC的HLC和各種細胞來源的類器官（iPSC、祖細胞、膽管細胞）為細胞治療提供了足夠的細胞來源。此外，iPSC和類器官在體內移植中始終具有更高的生存能力和效率。具有遺傳穩(wěn)定性和高度可擴展特性的類器官可能是治療終末期肝病的一種有前途的策略。肝臟中的不同細胞具有更換和重塑肝臟微環(huán)境的作用；

因此，將多種細胞治療結合起來可能是細胞治療的未來趨勢。細胞療法最顯著的優(yōu)勢是可以高度靈活地選擇最佳細胞和移植部位進行治療，以滿足患者的需求。

參考資料：Hu, XH., Chen, L., Wu, H. et al. Cell therapy in end-stage liver disease: replace and remodel. Stem Cell Res Ther 14, 141 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03370-z

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